果樹流膠病研究的進(jìn)展與展望

侯義龍，莊 杰，趙 金，金曉彤，朱 然

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

流膠是某些果樹尤其核果類果樹櫻桃、桃、杏、李等普遍發(fā)生的病害，近年在蘋果園等也時有發(fā)生。果樹一旦患上此病便開始流膠，樹勢漸衰，病情嚴(yán)重時能造成整個果園毀滅，果樹的產(chǎn)量和質(zhì)量也受到嚴(yán)重影響。以前人們認(rèn)為果樹流膠病屬于生理性病害，后來人認(rèn)識到果樹流膠病的病因既有生物因素也有非生物因素。目前全球范圍內(nèi)還沒有很好的防治措施，必須將化學(xué)方法、物理方法、生物方法結(jié)合起來進(jìn)行綜合防治，才是抑制果樹流膠病發(fā)生，促進(jìn)果樹生長，提高果品產(chǎn)量和質(zhì)量的有效措施。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，對流膠病的發(fā)病原因、發(fā)病機(jī)制的研究逐漸深入到分子生物學(xué)領(lǐng)域，可望從遺傳本質(zhì)上揭示果樹流膠病的發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步的有效防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 果樹流膠病癥狀及發(fā)病規(guī)律

1.1 果樹流膠病癥狀

生理性流膠的癥狀：主要發(fā)生在主干和主枝上。雨后樹膠與空氣接觸變成茶褐色硬質(zhì)琥珀狀膠塊，被腐生菌侵染后病部變褐腐爛，致使樹勢越來越弱，嚴(yán)重者造成死樹，雨季發(fā)病重，大齡樹發(fā)病重，幼齡樹發(fā)病輕。

侵染性流膠的癥狀：主要為害枝干。病菌侵染當(dāng)年生枝條，多從傷口和側(cè)芽處入侵，出現(xiàn)以皮孔為中心的瘤狀突起，當(dāng)年不流膠，具有潛伏侵染特征，次年瘤皮開裂溢出膠液，發(fā)病后期病部表面生出大量梭形或圓形的小黑點(diǎn)，1年有2次高峰期，5月上旬至6月上旬1次，8月下旬至9月上旬1次，這是與生理性流膠最大的區(qū)別。

1.2 果樹流膠病發(fā)病規(guī)律

生理性流膠病發(fā)病規(guī)律：主要是由于霜害、凍害、病蟲害、雹害、水分過多或不足、施肥不當(dāng)、修剪過重、結(jié)果過多、土質(zhì)粘重或土壤酸度過高等原因引起。樹齡大的桃樹發(fā)病重。

侵染性流膠發(fā)病規(guī)律：病菌以菌絲體、分生孢子器在病枝里越冬，次年3月下旬至4月中旬散發(fā)生分生孢子，隨風(fēng)而傳播，主要經(jīng)傷口侵入，也可從皮孔及側(cè)芽侵入引起初侵染，可進(jìn)行再侵染。特別是雨天從病部溢出大量病菌，順枝干流下或濺附在新梢上，從皮孔、傷口侵入，成為新梢初次感病的主要菌源，枝干內(nèi)潛伏病菌的活動與溫度有關(guān)。當(dāng)氣溫在15℃左右時，病部即可滲出膠液，隨著氣溫上升，樹體流膠點(diǎn)增多，病情加重，且土壤粘重、酸性較大、排水不暢時易發(fā)生。

2 果樹流膠病的發(fā)病原因及病原菌的鑒定

2.1 發(fā)病原因

Griffin和Barss于1911年對果樹流膠病進(jìn)行了相關(guān)報道[1,2]。很長一段時間以來，對于果樹流膠病的致病原因一直存在爭議，過去人們多認(rèn)為果樹流膠病屬于生理性病害。隨著研究的深入，通過病原菌的分離、接種試驗研究，國內(nèi)外也有關(guān)于病原菌引起的侵染性流膠病的報道。

果樹流膠病是由多種因素引起的，一種是由于生理失調(diào)引起的（生理性流膠?。ＶΩ刹『?、蟲傷、凍害、雹傷等都能導(dǎo)致流膠。其它如水分失調(diào)（如雨水過大）、修剪過重、結(jié)果過多、氮肥過多、栽植過深、土壤過酸、土質(zhì)粘重等，也會加重流膠病的發(fā)生。一種是由真菌侵染引起的（真菌性流膠病）。病原菌以分生孢子器、菌絲體在病枝里越冬，第二年3月下旬至4月中旬散出分生孢子，孢子隨風(fēng)傳播，主要經(jīng)傷口侵入，也可從皮孔及側(cè)芽侵入引起初侵染，可進(jìn)行再侵染。陳祥照研究認(rèn)為，桃樹流膠病病菌有潛伏侵染性，在南京病菌從4月開始侵入新梢，到10月下旬停止活動，進(jìn)入越冬階段，病菌的分生孢子是隨雨水傳播，傷口、皮孔及側(cè)芽等為病菌入侵途徑[3]。為了明確影響廣西地區(qū)桃樹流膠病發(fā)生的關(guān)鍵因子，2012～2014年，萬保雄等以廣西油桃主栽品種“中油5號”為研究對象，對流膠病發(fā)病較輕及發(fā)病較重的兩個產(chǎn)區(qū)的48個果園進(jìn)行調(diào)查，從礦質(zhì)營養(yǎng)、植物生理角度出發(fā)，并結(jié)合立地條件、氣候環(huán)境等因子進(jìn)行系統(tǒng)研究和對比，結(jié)果證實，葉片Zn、Mg含量、年降雨量是桃流膠病發(fā)生的關(guān)鍵影響因子，南方春、夏季長時間高溫和降雨等不良?xì)夂蚴橇髂z病的重要誘因[4]。為了明確降雨對桃流膠病發(fā)生的影響，萬保雄等以8年生“天津水蜜桃”為研究對象，進(jìn)行避雨栽培試驗觀察桃流膠病發(fā)生情況。結(jié)果表明，降雨對桃流膠病發(fā)生有重要影響，避雨栽培可有效減輕桃流膠病的發(fā)生[5]。劉勇等對分布于湖北產(chǎn)區(qū)的22個桃園流膠病的發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果顯示，溫度、降水量、土壤質(zhì)地、肥水管理、多效唑與除草劑的使用、蟲害等是導(dǎo)致流膠病的重要原因，其中溫度可能是導(dǎo)致流膠病發(fā)生的關(guān)鍵因素[6]。阿里木·買買提等于2013～2014年對新疆輪臺縣杏樹流膠病發(fā)生危害及發(fā)病相關(guān)因子開展了調(diào)查，調(diào)查結(jié)果顯示，該縣杏樹流膠病的發(fā)生與樹齡樹勢、立地條件、栽培管理水平及栽植密度關(guān)系密切。盛果期杏樹較幼齡期發(fā)病嚴(yán)重，低主干杏園較高主干杏園發(fā)病嚴(yán)重，不同間作模式的杏園發(fā)病程度也存在差異[7]。

2.2 病原菌的鑒定

病原菌的分離鑒定是有針對性防治果樹流膠病及抗病品種選育研究的基礎(chǔ)。為此，果樹流膠病病原菌的鑒定引起了科技工作者的廣泛重視。為了明確山東省桃樹流膠病的病因，張勇等采用rDNA-ITS序列分析和真菌形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方式，對引起桃樹流膠病的病原菌進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，引起山東桃樹流膠病病原菌主要為葡萄座腔菌[Botryosphaeria dothidea （Moug. ex Fr.）Ces et de Not]。傷口和皮孔是病原菌田間主要的侵染途徑[8]。通過病菌分離培養(yǎng)、切片鏡檢和人工接種試驗，張寶棣等查明廣州地區(qū)桃樹流膠病可由Leptosphaeria pruni Woronichin和Cucurbitaria sp.兩種子囊菌分別侵染所致，二者與國內(nèi)外報道的病原真菌Botryosphaeria dothidea和phasalospora persicae都不相同，前者為廣東省首次報道，后者則為國內(nèi)首次報道[9]。王璠等從湖北省咸寧市、荊門市、孝感市、隨州市等地果園采集桃樹流膠病枝條樣本100份。采用組織分離法分離病斑，獲得近30種真菌分離物，將這些分離物純化后，在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)性狀和孢子形態(tài)進(jìn)行鑒定，分離到的菌株有殼梭孢(Fusicocum spp.)、鏈格孢( Alternaria spp.)、盤多毛孢(Pestalotia spp.)等種類。致病性研究初步證實殼梭孢和盤多毛孢類真菌可能為桃流膠病的致病菌[10]。劉娟等從金柑流膠病株上分離純化得到5株真菌，通過形態(tài)特征觀察、致病性測定以及形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定。證實這5株真菌分屬于鏈格孢、葉點(diǎn)霉Phyllosticta sp.和鐮孢霉Fusarium sp.，且致病程度不同[11]。肖倩莼等鑒定芒果流膠病病原菌為Diplodia sp.和Colletotrichum sp.[12]。李紅葉等證實引起梅樹流膠病的病原真菌有兩種，葡萄座腔菌和可可球二孢菌〔Botryodiplodia theobromae pat. (Syn Lasiodiplodia theobromae（pat.）Griff&Maubl.〕，分別引起枝腐型流膠和干腐型流膠[13]。程玉芳(通過培養(yǎng)特性、分生孢子形態(tài)學(xué)、分子系統(tǒng)學(xué)和致病性研究證實湖北地區(qū)桃樹流膠病病原菌為葡萄座腔菌[14]。阿里木·買買提等)研究證實新疆輪臺縣杏樹侵染性流膠病的病原菌為鏈格孢菌（Alternaria alternata）[15]。郭利民等通過組織分離培養(yǎng)、致病性測定，明確河南省真菌性流膠病的病原主要為葡萄座腔菌[16]。

3 果樹流膠病發(fā)病機(jī)理

乙烯的產(chǎn)生無論是對侵染性還是非侵染性流膠病的發(fā)生都具有重要的作用。Boothby等研究發(fā)現(xiàn)樹膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)與某些細(xì)胞壁多糖的結(jié)構(gòu)相同，樹膠多糖的過度合成可能是由乙烯的產(chǎn)生引起的，從而引起流膠病的發(fā)生[17]。

N、K水平與檸檬抵御流膠病病原菌侵染能力有密切關(guān)系。魏勝林的研究表明，營養(yǎng)液中N濃度大于240 mg/kg時，樹體對流膠病抵御能力降低，K濃度小于220 mg/kg時，提高K濃度能明顯提高樹體對流膠病的抵抗能力。葉片中全多酚的含量與樹體抗流膠病能力強(qiáng)弱有關(guān)，營養(yǎng)液中N濃度為240 mg/kg，K濃度為220 mg/kg，葉片全多酚含量為9.17 mg/g時，樹體具有較強(qiáng)的抵抗流膠病的能力[18]。

鄭雪芳等對不同藥劑防治桃樹流膠病后，桃葉氧化酶活性與防效的相關(guān)性進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，不同藥劑處理后，桃樹葉片組織中過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPOD)與桃樹流膠病的病情存在一定的相關(guān)性。試驗結(jié)果表明，不管是經(jīng)由兩種藥劑共同處理還是單一藥劑處理，還是不經(jīng)任何藥劑處理的對照組，POD和PPOD的活性低峰均出現(xiàn)在5月20日左右。另外，經(jīng)兩種藥劑聯(lián)合處理的桃樹葉片的POD和PPOD值均略高于一種藥劑處理的，明顯高于未經(jīng)任何處理的對照桃樹葉片中的POD和PPOD值[19]。

為進(jìn)一步明確流膠病菌與寄主的互作機(jī)理，劉勇等分別以流膠病菌侵染的高抗“豐光”和敏感“紫金紅”油桃作為研究材料，同時以健康油桃作為對照，采用RNA-seq技術(shù)對4組不同處理樣品進(jìn)行高通量測序。所有差異表達(dá)基因的GO、COG、KEGG顯著性富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因主要富集在病原菌與寄主互作過程中的相關(guān)分子途經(jīng)中，其中部分基因在高抗“豐光”油桃中 特異性高豐度表達(dá)，表明這些基因在流膠病菌與寄主的互作過程中可能起著重要作用，其具體作用機(jī)制值得進(jìn)一步探討[20]。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李智從生理生化、組織病理、糖代謝及基因表達(dá)等方面，對桃流膠病發(fā)病過程進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，桃枝條在遭受病原菌侵染后與防御相關(guān)基因的表達(dá)以及生理生化方面均發(fā)生了改變，如過氧化氫和花青素含量增加，苯丙氨酸解氨酶活性以及防御相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)。此外，病原菌導(dǎo)致寄主細(xì)胞降解和膠體的形成，與細(xì)胞壁降解的相關(guān)基因表達(dá)顯著增加。桃病原性流膠病發(fā)病過程中糖代謝也發(fā)生了明顯的變化。桃枝條內(nèi)的可溶性糖，甘露糖，阿拉伯糖和木糖含量，在接種病原菌后具有不同程度的增加；山梨醇、蔗糖和果糖含量總體上呈現(xiàn)下降趨勢；經(jīng)qRT-PCR研究表明，GDP-L-galactose和L-galactose的合成受到抑制，UDP-D-galactose、UDP-D-glucuronate、UDP-D-arabinose和UDP-D-xylose的合成增強(qiáng)，這些物質(zhì)是多糖合成的直接前體；通過切面觀察和過碘酸雪夫試劑染色表明，接種病原菌后多糖在一年生桃枝條中有明顯積累；糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白表達(dá)增強(qiáng)[21]。

4 果樹流膠病的防治措施

4.1 抗病品種的選育

選育抗病品種是流膠病防治的重要手段。不同的果樹樹種、同一果樹不同品種對流膠病的抗性不同，此為果樹流膠病抗性品種的選擇提供了前提條件。張慧琴等從上海水蜜桃的實生材料中篩選出一株高抗桃樹流膠病的桃樹，命名為“東溪小仙”，該品種的流膠病發(fā)病率和病情指數(shù)僅是上海地區(qū)主栽桃樹品種“湖景蜜露”桃的19.6%和17.8%[22]。Moreira等從20個野生腰果品系中篩選到3個對流膠病具有抗性的品系[23]，Cardoso等也篩選到一個矮腰果品系具有一致穩(wěn)定的抗性[24]。楊文初步評價了桃樹6個品種對桃流膠病菌的敏感性，發(fā)現(xiàn)桃品種“春雪”的敏感性最強(qiáng)，“慶豐”和“倉方早生”敏感性中等，而“霞暉5號”“大紅袍”和“鄂桃1號”的敏感性最弱[25]。 陳令會等調(diào)查了浙江臺州地區(qū)設(shè)施栽培條件下“紅蜜”“拉賓斯”和“范短”3個甜櫻桃品種的流膠病發(fā)病情況和綜合表現(xiàn)。結(jié)果表明：3個甜櫻桃品種中，“拉賓斯”的綜合表現(xiàn)最優(yōu)，其次為“紅蜜”“范短”的表現(xiàn)稍差[26]。劉勇等在對分布于湖北產(chǎn)區(qū)的22個桃園流膠病的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)一些高抗品種資源如“桃巴旦”“豐光”“棗陽黃桃”“鄂桃1號”等，為選育抗流膠病的桃新品種奠定了基礎(chǔ)[6]。向宇等利用系統(tǒng)聚類和相關(guān)分析方法，對20種觀賞桃的流膠病發(fā)病情況進(jìn)行了比較性調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)“灑紅桃”“灑紅龍柱”“菊花桃”“緋桃”的流膠病發(fā)病率和病情指數(shù)均較低，為抗流膠病的觀賞桃品種[27]。

4.2 加強(qiáng)果園管理，壯樹抗病

果樹流膠病的發(fā)生往往和樹勢強(qiáng)弱有關(guān)，加強(qiáng)管理水平，有利于增強(qiáng)樹勢，從而減輕流膠病的發(fā)生。王和朋報道，采用物理方法與化學(xué)方法（藥劑防治）相結(jié)合防治桃樹流膠病，獲得了很好的防治效果。物理防治法貫穿于建園、選苗、栽植、灌溉、修剪、清園等各環(huán)節(jié)。盡量選擇陽坡或平地建園，避免栽植于黏重土壤，結(jié)合整地一次性施足基肥。選擇健壯無病蟲害的毛桃砧木嫁接苗最好。栽植時最好為起壟栽植，并挖好排水溝。灌溉方式采用滴灌或水肥一體化的方法，避免大水漫灌。改冬季修剪為夏冬結(jié)合修剪，直徑1 cm以上的剪鋸口全部涂抹保護(hù)劑或封口。采果后和落葉后注意清園，冬季樹干涂白，防止凍害[28]。

4.3 藥劑防治

目前生產(chǎn)上用于防治果樹流膠病的化學(xué)藥劑主要有氟硅唑、撲海因、多菌靈、三唑類殺菌劑（戊唑醇、己唑醇、烯唑醇）和有機(jī)氯類殺菌劑等。防治時一般采用多種化學(xué)藥劑聯(lián)合應(yīng)用。除了使用傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑防治外，科技工作者們也十分重視化學(xué)藥劑的試驗研究，努力尋找新的更有效的藥劑。張淑燕等測定了5種殺菌劑對從扁桃流膠病植株上分離的葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea菌絲生長的毒力。結(jié)果表明，8-羥基喹啉酮對扁桃流膠病病菌有顯著的抑制作用，抑菌效果明顯優(yōu)于多菌靈、甲基托布津、代森錳鋅和百菌清[29]?？祖返葘μ饳烟伊髂z病進(jìn)行了不同藥劑的防治試驗研究，篩選出了對甜櫻桃流膠病防治效果較好的藥劑10%丙硫多菌靈（丙硫唑）懸浮劑[30]。張廣仁等通過10%多福懸浮藥劑對杏樹流膠病的試驗研究發(fā)現(xiàn)，5倍和10倍濃度的10%多福懸浮藥劑抑制和防治杏樹流膠病效果較好[31]。李華文進(jìn)行了LD系統(tǒng)環(huán)保型藥物治療柑桔流膠病試驗，結(jié)果表明：除20%LD-1A治愈率較低外，50% LD-2A、20% LD-1B、50% LD-2B和LD-3D原液對柑桔流膠病的治愈率達(dá)80%～95%，均可在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用[32]。紀(jì)兆林等測定了9類16種殺菌劑對桃流膠病菌葡萄座腔菌Botryosphaeria spp.的毒力效果。結(jié)果顯示，毒力作用最強(qiáng)的殺菌劑是丙環(huán)唑，其次是多菌靈和咪鮮胺[33]。潘佑找等以雨花露桃(Amygdalus persica L.)為試材，在江漢平原地區(qū)于4～6 月份用幾種藥劑對桃樹流膠病進(jìn)行了防治試驗。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)噴施3 g/L的硼砂溶液+每株土施硼砂50 g、涂抹5°Be石硫合劑、涂抹50%退菌特粉劑等三種處理對防治桃樹流膠病效果較好[34]。

4.4 生物防治

生物防治具有環(huán)境友好性，符合綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的要求而越來越受到重視，生物防治成為果樹流膠病防治非常有潛力的防治方法。

生防菌株的篩選是果樹流膠病生物防治的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。楊艷敏從桃樹根莖葉部位共分離到內(nèi)生細(xì)菌129株，最后篩選出一株拮抗作用最好的菌株HAR3，經(jīng)鑒定，該菌為解淀粉芽孢桿菌[35]。董施源等從健康桃樹葉片中分離篩選到一株內(nèi)生細(xì)菌J5，J5對桃流膠病菌可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)JMB-122菌株有較強(qiáng)拮抗作用。結(jié)合磷脂脂肪酸鑒定、16SrDNA鑒定以及微生物自動鑒定系統(tǒng)的分析結(jié)果，將J5鑒定為枯草芽孢桿菌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)J5可在桃樹體內(nèi)存活至少2年以上。離體致病力測定表明，經(jīng)J5定殖處理或其發(fā)酵濾液處理的桃樹枝條在接種JMB-122后產(chǎn)生的病斑長度均較對照的小。J5定殖的桃樹枝條接種7 d后病斑長度為14.0 mm，而對照枝條接種后病斑長度達(dá)到32.5 mm，表明內(nèi)生細(xì)菌J5能有效抑制桃樹流膠病的發(fā)生，在防治上有一定應(yīng)用潛力[36]。

5 展望

果樹流膠病是一種全球性的果樹病害，給果樹生產(chǎn)造成很大的損失。目前世界范圍內(nèi)還沒有十分有效的防治措施，綜合防治是減輕果樹流膠病發(fā)生，促進(jìn)果樹生長，提高果品產(chǎn)量和質(zhì)量的有效措施。筆者認(rèn)為，今后果樹流膠病的研究的關(guān)注點(diǎn)一是果樹流膠病發(fā)病機(jī)制的研究，尤其是從分子生物學(xué)領(lǐng)域加深研究，可望從遺傳本質(zhì)上揭示果樹流膠病的發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步的有效防治提供更為準(zhǔn)確可行的方案。二是進(jìn)一步深入加大生物防治藥劑的研究和開發(fā)應(yīng)用力度，符合生態(tài)環(huán)保的社會發(fā)展原則和理念。