黑廣肩步甲觸角感器的掃描電鏡觀察

于庭洪王林美譚吉眾李喜升宋 策陳增良

(1.遼寧省蠶業(yè)科學研究所，遼寧 鳳城 118100； 2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院，遼寧 大連 116023； 3.莊河市農(nóng)業(yè)發(fā)展服務中心，遼寧 莊河 116400)

黑廣肩步甲CalosomamaximovicziMorawitz，又名大星步甲，屬鞘翅目Coleoptera，步甲科Carabidae，星步甲屬Carabidae，捕食性極強，是柞蠶的重要捕食性害蟲之一[1]。 近年來受全球氣候變暖因素影響，危害面積不斷擴大，呈現(xiàn)由南向北擴散趨勢，遼寧及河南等柞蠶主產(chǎn)區(qū)均受其害。

昆蟲的頭部既是神經(jīng)中樞，也是感受中心，其上面著生著不同類型的感受器，受棲息環(huán)境影響差異很大，感受器大致可分為感觸器、聽覺器、感化器和視覺器。 昆蟲的感器大多由表皮特化形成，是昆蟲接受各種外界信息的主要門戶。 觸角是昆蟲感覺器官，觸角上著生有許多不同種類的感受器，具有感受氣味、氣流、濕度、溫度、機械振動等功能，在尋覓食物、種內(nèi)及種間信息交流、躲避危險、尋找配偶、感受環(huán)境、等一系列適應行為過程中發(fā)揮重要作用[2]。 研究昆蟲觸角感器，探究觸角感器的種類、數(shù)量、分布和功能，可以為確定昆蟲觸角感器與昆蟲行為反應的關系，了解這些感器在昆蟲尋覓食物、躲避危險和交配繁殖等方面所起的作用，探明昆蟲的行為學機制奠定基礎[3]。

近年來，國內(nèi)外學者先后對CarabusProdigus[2]、CarabusfiduciariussaishutoicusCsiki[4]、Platynusassimilis(Paykul1)[5]、Platynusdorsalis(Pontoppidan)[6]、BembidionlamprosHbst[7]、BembidionproperansSteph[8]、Paussus favieri[9]以及Typhlocharis屬[10]等步甲科昆蟲的觸角感器進行了描述，并結(jié)合電生理試驗對主要感器的功能進行了探討[2，5，9]。 本文通過掃描電鏡技術，研究黑廣肩步甲成蟲觸角感器的類型、數(shù)量和分布規(guī)律，比較雌、雄兩性間的差異，本研究通過對黑廣肩步甲觸角感器進行掃描電鏡觀察，研究其觸角上各種感器在種類、分布和微觀形態(tài)特點，觀察其成蟲觸角上各種感器類型和分布規(guī)律，為進一步的開展黑廣肩步甲的觸角電位(EAG)反應以及黑廣肩步甲的綠色安全防控研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 供試昆蟲

黑廣肩步甲成蟲采用誘芯結(jié)合陷阱誘捕器誘捕法[11]，釆集時間為2016 年8 月中下旬，每隔1 d 采集1次，黑廣肩步甲采集后，帶回實驗室用五齡柞蠶在實驗室內(nèi)飼養(yǎng)，溫度為室溫條件，相對濕度為50%～80%。

供試儀器、試劑：電子解剖鏡、日立SM-6360LV 型掃描電子顯微鏡；99%二氯甲烷、15%戊二醛、丙酮均為國產(chǎn)分析純、0.1 mol/L pH 7.2 磷酸緩沖液。

1. 2 方法

1. 2. 1 雌雄的鑒別

觀察黑廣肩步甲成蟲前足跗節(jié)基部3 節(jié)，寬大的為雄蟲，細小的為雌蟲。

1. 2. 2 樣品的處理、制備和掃描電鏡觀察

取大小基本一致的雌、雄成蟲各6 頭，在解剖鏡下用彎頭鑷子將觸角取下，先用蒸餾水反復清洗，再用生理鹽水繼續(xù)超聲波清洗，然后將其頭部放入70%乙醇中保存?zhèn)溆谩?測試時用15%戊二醛在冰箱中冷藏室中固定4 h，然后將保存的樣本置于1%鋨酸中固定2 h。 將樣品依次放入30%、45%、60%、75%和90%丙酮進行梯度脫水，每個處理30 min，脫水后置于干燥器中干燥2 h，接著在解剖鏡下將觸角粘在樣本臺上，放入真空噴金儀進行噴金鍍膜。 最后使用日立SM-6360LV 型掃描電子顯微鏡，分別對雌、雄成蟲頭部觸角各節(jié)感器的形態(tài)和數(shù)量選擇合適 視野進行拍照觀察，加速電壓為15kv。 利用AdobePho- toshopCS2. 0 軟件對圖片進行標記；使用DigitalMicrograph 軟件對拍攝的觸角及感器照片進行測量，測量每種感器的長度和基部直徑等，最后進行統(tǒng)計分析。

1. 3 觸角感器的命名

感器的鑒定和命名主要參照Schneider (1964)[12]與Merivee (2000)[7]的標準進行。 同時，參考國內(nèi)外近年來關于步甲頭部感器的研究成果。

1. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)掃描電鏡拍攝的照片，利用ImageJ 軟件測量感器的長度和基部直徑，利用Photoshop CS6. 0 軟件對電鏡照片進行處理。 所有數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計分析軟件SPSS16. 0進行處理。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黑廣肩步甲觸角形態(tài)特征及各節(jié)長度比較

黑廣肩步甲雌、雄成蟲觸角均呈線狀，著生于頭部兩側(cè)觸角窩中。 雌、雄成蟲觸角均分為柄節(jié)(scape)、梗節(jié)(pedicel)和鞭節(jié)(flagellum)3 部分，其中鞭節(jié)又分為9 個亞節(jié)。 通過解剖鏡下照像觀察，雌成蟲的柄節(jié)和梗節(jié)的形態(tài)完全一致，其中鞭節(jié)第一節(jié)最長，柄節(jié)第二，其余鞭節(jié)差異不明顯，梗節(jié)最短，呈圓珠狀。 雄蟲觸角總長度及各節(jié)長度均長于雌蟲觸角，其中雌蟲觸角長度12. 67±0.49 mm，雄蟲觸角長度14.63±0.46 mm(見表1)，雌、雄蟲的觸角長度差異極顯著(p＜0.01)。 觸角鞭節(jié)各節(jié)長度，均是雄蟲長于雌蟲，其中鞭節(jié)第一節(jié)最長，雌蟲1.91±0.10 mm，雄蟲2. 19±0.14 mm，其余各鞭節(jié)相差不明顯，靠近基部各節(jié)稍長，端部各節(jié)稍短(見表2)。

2. 2 黑廣肩步甲觸角感器類型

黑廣肩步甲雌、雄成蟲觸角的感器類型完全相同，通過掃描電鏡觀察均為7 類、14 種感器類型，包括2 種毛形感器(Sensilla trichodea，St)、3 種刺形感器(Sensill achaetica，Sch)、5 種錐形感器(Sensilla basiconca，Sb)、1 種腔形感器(Sensilla cavity，Sca)、1 種腔錐形感器(Sensilla coeloconica，Sco)、1 種鐘形感器(Sensilla campaniformia，Scam)和1 種栓錐形感器Sensilla styloconica，Ss)(表3)。

表 1 黑廣肩步甲成蟲觸角各節(jié)長度比較 (mm)

表 2 黑廣肩步甲成蟲觸角鞭節(jié)各節(jié)長度比較 (mm)

表 3 黑廣肩步甲感器的形態(tài)特征 (單位：μm)(n=10)

2. 2. 1 毛形感器(Sensilla trichodea,St)

毛形感器(St)是觸角上數(shù)量最多的一類感器，毛狀，長短不一。 頂端尖或鈍，整體直立或微彎，基部窩寬或窄。 分布在大部分鞭節(jié)的背面和腹面中，柄節(jié)和梗節(jié)則無此感器。 可以分為兩個亞型：St. 1 和St. 2。 其中，St. 1主要分布在鞭節(jié)的3 ～9 節(jié)。 St. 2 也分布在鞭節(jié)的3 ～9節(jié)。

St.1，長度為80. 73±8. 06 μm，基部直徑為8. 35±1.72 μm。 從基部向頂端逐漸彎曲并變細變尖，感器壁上有凸起的縱脊顯得粗糙，整體形似鐮刀狀，彎曲程度或大或小，基部窩較窄，端部較尖細(見圖1：A)。

St.2，長度為175. 50±36. 08 μm，基部直徑為12. 08±1.69 μm。 端部鈍或尖，感器壁光滑無縱脊，整體筆直，基部窩較寬，端部稍鈍圓(見圖1：B)。

2. 2. 2 刺形感器(Sensilla chaetica,Sch)

刺形感器是黑廣肩步甲分布最廣的感器之一，鞭節(jié)的1 ～9 節(jié)都有分布，根據(jù)其著生位置、頂端的尖鈍程度、表面的光滑程度、直立或彎曲狀態(tài)以及基部窩的寬窄，可以分為3 種亞型： Sch.1，Sch.2 和Sch.3。

Sch.1，成簇分布于鞭節(jié)的5 ～9 節(jié)，長度為20. 42±3.14 μm，基部直徑為4.49±0.39 μm。 頂部鈍尖，成簇分布于各鞭節(jié)靠近基部位置，且垂直于觸角表面，剛直如刺，基部略粗，且有略微突起的臼狀窩(見圖1：C)。

Sch. 2，分布于鞭節(jié)的3 ～9 節(jié)，長度為38. 08 ±6.96 μm，基部直徑為6. 67±0. 79 μm。 零星分布于鞭節(jié)的5 ～9 節(jié)，頂端鈍尖，基部垂直于觸角表面，端部向觸角基部彎曲呈鐮刀形，基部窩較窄(見圖1：D)。

Sch.3，分布于1 ～9 節(jié)靠近端部的位置，長度為186.20±18.71 μm，基部直徑為20. 67±3.49 μm。 是刺形感器中最長的一種，頂端鈍尖，表面光滑，直立于觸角靠近端部位置，基部窩較大(見圖1：E)。

2. 2. 3 錐形感器(Sensilla basiconica Sb)

直立，形似錐子，生長于圓形穴上或穴內(nèi)，有或無基部窩，感器長度較其它感器短。 根據(jù)中間柱狀主體是否著生在基部窩內(nèi)或基部窩上、錐體長度、基部直徑、頂端尖或鈍或整體直立微彎情況，可以分為5 種亞型： Sb. 1、Sb.2、Sb.3、Sb.4 和Sb.5。

Sb.1，感器長度為1.38±0.40 μm，基部直徑為2.42±0.34 μm。 頂端呈圓球狀，感器壁光滑，直立于基部窩之內(nèi)，基部窩較寬，錐體短小、粗壯(見圖1：F)。

Sb.2，感器長度為4.68±1.01 μm，基部直徑為2.66±0.47 μm。 頂端鈍圓，表面光滑，與觸角表面呈一定角度夾角，基部窩較窄(見圖1： G)。

Sb.3，感器長度為4.61±1.29 μm，基部直徑為2.62±0.29 μm。 頂端鈍圓，表面光滑，與觸角表面垂直，基部窩不明顯，錐體短小、粗壯(見圖1：H)。

Sb.4，感器長度為6.33±0.29 μm，基部直徑為2.59±0.50 μm。 頂端鈍圓，表面光滑，與觸角表面呈一定角度夾角，生長在突出的錐臺上，基部窩明顯，錐體較細長(見圖1：I)。

Sb.5，感器長度為14.77±1.55 μm，基部直徑為4. 06±0.35 μm。 頂端尖圓，靠近基部錐體具脊狀突起，表面光滑，中上部稍彎曲，基部窩較淺(見圖1：J)。

2. 2. 4 腔錐形感器(Sensilla coeloconica,Sco)

外形呈圓盤狀，基部直徑為18. 07±2. 14 μm，腔口直徑0.81±0.20 μm，表皮凹陷，錐體鑲嵌于中心空腔之中，透過表面小孔可以看見內(nèi)部的錐體(見圖1： K)。

2. 2. 5 腔形感器(Coeloconicasensilla,Sca)

空腔直徑2. 33±0. 37 μm。 表皮內(nèi)陷形成的空腔，內(nèi)部無錐體，觸角表面呈耳窩狀深陷。 (見圖1：L)

2. 2. 6 鐘形感器(Sensilla campaniformia,Scam)

外形呈球面狀突起，邊緣較厚，基部直徑為11. 80±0.59 μm，中間乳狀突起直徑1. 45±0.33 μm。 (見圖1：M)

2. 2. 7 栓錐形感器(Sensilla styloconica,Ss)

感器直立，形似錐子，頂端鈍圓，與錐形感器無太大區(qū)別，但著生于圓形栓體上，錐體及栓體基部窩均較深。錐體長 度4. 53 ± 0. 73 μm，栓體基部直徑為7. 11 ±0.44 μm。 (見圖1： N)

2. 3 觸角感器的分布與數(shù)量

黑廣肩步甲柄節(jié)和梗節(jié)的感器數(shù)量較少，僅發(fā)現(xiàn)有Sch.3 的分布。 鞭節(jié)上感器的數(shù)量和種類較多，包括毛形感器、刺形感器、錐形感器、腔錐形感器、腔形感器、鐘形感器和栓錐型感器等。 觸角感器在觸角上的分布極不一致，整體情況是從基節(jié)、柄節(jié)到鞭節(jié)，感器的種類與數(shù)量是呈直線上升的，基節(jié)最少，端部鞭節(jié)最多。 因此，在統(tǒng)計感器數(shù)量時，用Photoshop CS 6.0 軟件在其著生位置選取具有代表性的部位進行統(tǒng)計，計數(shù)后估算分布的實際密度，即每mm2所包含感器的數(shù)量。 毛形感器(St)在觸角上分布較廣，在鞭節(jié)的3 ～9 節(jié)均有分布，基節(jié)、柄節(jié)和鞭節(jié)的1 ～2 節(jié)則無此感器。 主要存在兩個亞型：St. 1和St.2。 其中，St.1、St. 2 分布密度大約400 個/mm2。 刺形感器(Sch)是觸角中分布最廣的一類感器，在鞭節(jié)的1～9 節(jié)均有分布，甚至基節(jié)、柄節(jié)也偶有分布。 其中，Sch.1成簇分布在鞭節(jié)的4 ～9 節(jié)，分布密度大約7 000 個/mm2，其余各節(jié)則無此感器。 Sch.2 零星分布在鞭節(jié)的3 ～9 節(jié)，其余各節(jié)則無此感器。 Sch.3 是毛型感器中最長的亞型，分布密度1 ～10 根不等，在基節(jié)也有分布最少，且僅有1根，長度甚至超過1 mm。 錐形感器(Sb)的種類較多，分布較廣，主要分布在鞭節(jié)的4 ～9 節(jié)，但基節(jié)、柄節(jié)和鞭節(jié)的1 ～3 節(jié)沒有分布。 Sb.1 數(shù)量最少，僅在第9 節(jié)有分布，200/mm2左 右； Sb. 2 數(shù) 量 較 少， 分 布 密 度 大 約200 個/mm2； Sb. 3 數(shù) 量 較 多， 分 布 密 度 大 約5 000 個/mm2；Sb.4 數(shù)量稍少一些，分布密度大約2 000個/mm2；Sb. 5 數(shù)量較多，分布密度大約9 000 個/mm2。腔錐形感器(Sco)，分布于鞭節(jié)的3 ～9 節(jié)，鞭節(jié)的1 ～2節(jié)、柄節(jié)和梗節(jié)無此感器，分布密度大約500 個/mm2。 腔形感器(Sca)，分布在鞭節(jié)的3 ～9 節(jié)，其它各節(jié)則無此感器，分布密度大約500 個/mm2。 鐘形感器(Scam)，分布在鞭節(jié)的5 ～9 節(jié)，分布密度大約400 個/mm2。 栓錐形感器(Ss)，分布在鞭節(jié)的3 ～9 節(jié)，其它各節(jié)則無此感器，分布密度大約3 000 個/mm2。

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)7 類、14 種黑廣肩步甲觸角感器，包括2種毛形感器、3 種刺形感器、5 種錐形感器、1 種腔錐形感器、1 種腔形感器、1 種鐘形感器和1 種栓錐形感器。 黑廣肩步甲所有感器亦曾在其他步甲屬昆蟲觸角上被觀察到過[6 ～7]。

刺形感器(Sch)是觸角分布最廣泛的感器，通過對生長位置、生長角度、頂端的尖鈍程度、直立或彎曲的狀態(tài)，將刺形感器分為3 種亞型：Sch. 1，SCh. 2 和SCh. 3[7]。 本文的Sch. 1 有文獻將其歸為錐形感器，分布于5 ～11節(jié)[13]，而黑廣肩步甲Sch. 1 成簇分布在鞭節(jié)的4 ～9 節(jié)，且垂直于觸角表面，頂端稍尖；劉桂清等認為的Sch. 2 與本文Sch.2 掃描電鏟觀察的形狀、位置、角度等完成一致，并分散生長在鞭節(jié)的3 ～9 節(jié)；劉桂清等認為的Sch. 3 僅在柄節(jié)有1 個分布，但本文觀察通過Sch. 3 生長位置、長度及基窩深淺，本文認為應將其與生長在各鞭節(jié)中垂直于觸角表面，并大多生長在各鞭節(jié)端部的均歸為一類，即Sch.3。 從功能上看，步甲刺形感器多被認為是典型的機械感器，可感觸氣流或物體震動[14]。 在昆蟲各類感器的研究中，機械感器存在著相對統(tǒng)一的特征：毛狀或刺狀，體壁無孔，表面光滑或具表皮刻紋，端部尖細[6]。 Hallberg等報道歐洲玉米螟的刺形感器基于其結(jié)構行使接觸性化學受體的功能[15]。 本研究結(jié)果顯示黑廣肩步甲步甲的刺形感器外部形態(tài)符合機械感器的特征，推測具有鞭節(jié)間機械感受的功能[16]，有助于控制觸角的彎曲程度。

毛形感器(St)是觸角中數(shù)量最多，分布最廣的感受器之一。 主要特點是呈毛狀，基部具窩或突起，其形態(tài)特征也存在著差異，根據(jù)長短、粗細、彎曲程度等特征可分為多種亞型。 本文發(fā)現(xiàn)有兩個亞型：St. 1 和St. 2。 通過觀察比對發(fā)現(xiàn)奇步甲的St. 1 與本文的St. 1 在形狀上相似，其分布于5 ～11 節(jié)，而黑廣肩步甲則分布于3 ～9 節(jié)；Kim 等認為St.2 分布于5 ～11 節(jié)[17]，本文觀察St. 2 廣泛分布于3 ～9 節(jié)。 St. 1 一般認為，其類似于Sch. 1，Le RU等曾報道St.1 受單個枝狀晶體神經(jīng)細胞支配，具有典型的機械受體超微結(jié)構特征[8]，具有機械感受功能[7]。 通常認為St.2 在蛾類中具有性信息素感受功能，例如，歐洲玉米螟觸角的3 種毛形感器都包含有受體細胞，可對性信息素起反應[9]；而對步甲而言，一般認為St.2 具有聚集信息素感受功能的原因[15]。 黑廣肩步甲已被證明存在聚集信息素[18]，因此，推測St. 2 是該蟲的聚集信息素感受器。

錐形感器(Sb)形似錐子或短釘形，著生長于表皮或基窩內(nèi)，頂端圓鈍，基部窩有或無，較其它感器短。 錐形感器(Sb)一般散生于觸角上，常直立或沿觸角軸微彎曲，臼狀窩明顯或不明顯，端部較鈍圓。 錐形感器種類較多，包含多種亞型，拉步甲Carabus lafossei 有2 種 亞 型[19]。本文將此類感器分為Sb.1、Sb.2、Sb.3、Sb.4 和Sb.5 種亞型。 錐形感器其壁很薄，里面有豐富的神經(jīng)細胞，感覺細胞為模式雙極感覺神經(jīng)細胞，端突末梢形成微細胞樹狀突分支分布至表皮四壁的微孔或微管內(nèi)。 由微管具選擇通透性，因而具有識別氣味的能力，為一種嗅覺感器，對植物氣味刺激有感受作用。 腔錐形感器(Sco)是一種圓形鈕扣狀感器，感覺錐位于中心表皮凹陷中的感受器中央生有1 ～2 根感覺錐，表皮凹陷邊緣無緣毛或緣刺[20]。腔錐形感器為微小的凹陷結(jié)構，其中腔錐形感器的凹陷內(nèi)具錐形結(jié)構或無，外有一圈環(huán)繞的表皮，具有感受水蒸氣、二氧化碳、濕度變化、植物氣味等作用[21]。 在鱗翅目螟蛾科的一些昆蟲中，腔錐形感器被認為含有嗅覺受體細胞，可能被用來感受植物揮發(fā)物，而且Ochieng 等研究發(fā)現(xiàn)沙漠蝗蟲腔錐形感器主要用于感受植物氣味。 前期野外試驗證明柞蠶取食誘導的柞樹揮發(fā)物對黑廣肩步甲具有較強的引誘活性[11]，亦為錐形感器(Sb)與腔錐形感器(Sco)感受植物氣味提供了證據(jù)。

腔形感器是在卡氏步甲中數(shù)量最多的一種感器[22]，為表皮上的凹陷結(jié)構，似火山口，描述相同的感器在薊馬科Thripidae 中也有發(fā)現(xiàn)，為濕度感受器的功能[23]。

鐘形感器(Scam)表面呈球面狀突起[24]，中心有1 個錐狀感覺錐。 鐘形感器分布于鞭節(jié)上且數(shù)量少，已被證實可以敏銳感知溫度[25]，黑廣肩步甲依靠鐘形感器可以對棲息地進行選擇，避免過熱或過冷的情況出現(xiàn)，這在其他步甲上也有所描述，如通緣步甲Pterostichusaethiops[26]。

栓錐形感器(Ss)栓體具基部窩，頂部的臼狀窩內(nèi)生1錐狀感器[27]。 栓錐形感器內(nèi)部含有豐富的神經(jīng)細胞，具有感受濕度、味覺和嗅覺功能。 被認為在鱗翅目夜蛾科和卷蛾科昆蟲的研究發(fā)現(xiàn)其充當化學受體功能，但是在螟蛾科中行使溫度或濕度受體功能。

B?hm 氏鬃毛也是一種常見感器，大多垂直于觸角表面，主要分布在柄節(jié)和梗節(jié)的節(jié)間周圍，均成簇分布，鞭節(jié)上無此感器，它比刺形感器短而尖，表皮凹陷又比錐形感器細[28]，但本文未發(fā)現(xiàn)其中有B?hm 氏鬃毛，可能是因為褪化或拍攝角度問題。

本研究利電鏡掃描技術，對黑廣肩步甲觸角感器的超微結(jié)構進行形態(tài)觀察，對感器的種類、數(shù)量、分布規(guī)律等進行了探討，初步判斷了各感器的功能特征，研究結(jié)果可為今后進一步開展黑廣肩步甲科昆蟲的行為學、電生理學和綠色安全防控等研究提供理論基礎，并對將黑廣肩步甲作為天敵昆蟲開展人工助遷生物防治利用提供參考依據(jù)。 近年來，利用觸角電位儀(EAG)和單細胞記錄儀(SCR)等電生理儀器已明確了多種昆蟲各類感器的功能。 然而，由于生物本身在不同年份、不同氣候條件下，具有差異性，本研究推測歸納的黑廣肩步甲各類感器的功能僅為部分樣品的研究結(jié)果，具體功能還有待于今后結(jié)合透射電鏡和電生理學方法來研究證實，為進一步明確黑廣肩步甲的觸角感器功能、行為機制提供更充實的依據(jù)。