張衛(wèi)藝，張麗麗，直俊強，羅一鳴，孫 越

(北京市畜牧業(yè)環(huán)境監(jiān)測站，北京 10200)

0 引言

目前，微生物絮凝劑因有良好的脫色除濁效果，且不對環(huán)境產(chǎn)生二次污染，廣泛應用于飲用水處理、生活污水處理及畜禽養(yǎng)殖污水處理等。根據(jù)絮凝劑來源不同分為4類，包括微生物細胞絮凝劑、微生物細胞壁成分絮凝劑、微生物細胞代謝產(chǎn)物絮凝劑及由基因工程技術(shù)獲得的絮凝劑[1]。其中起絮凝效果的高分子物質(zhì)主要有多糖、蛋白質(zhì)、糖蛋白、纖維素和DNA等，因這些物質(zhì)的分子中含有多種官能團，且分子量高(一般在105以上)，在污水中能與其中的膠體懸浮物發(fā)生反應，聚集成大分子而沉淀下來，達到固液分離的目的[2]。目前，已有超過30種產(chǎn)絮微生物(如，紅平紅球菌、短棒狀桿菌等)的文獻報道[3]。本實驗以紅平紅球菌發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑對豬場廢水的處理效果為指標，旨在尋找菌液的最佳投加量[4]。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

試驗所用菌株為紅平紅球菌，購于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，菌種編號為BNCC337015；LB培養(yǎng)基，購于美國Sigma公司；營養(yǎng)肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基，購于美國Sigma公司；無水乙醇，購于國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈣，分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；高嶺土，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

THZ-82恒溫振蕩器，國華企業(yè)；BKQ-Z301高壓滅菌鍋，博科BIOBASE；2100Q便攜式濁度儀，哈希HACH；CR3200 COD消解儀，德國WTW；UV-2600紫外分光光度計，島津企業(yè)管理有限公司；PhotoLab 7100VIS紫外分光光度計，德國WTW；LE204E電子天平，METTLER TOLEDO。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌液發(fā)酵液的制備

(1)菌株活化：用無菌超純水稀釋菌株干粉，接種至營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基中，30℃，培養(yǎng)48h。

(2)菌株擴繁：每個固體培養(yǎng)集中挑取兩個紅平紅球菌菌落，接種至10mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃，培養(yǎng)24h。

(3)搖瓶發(fā)酵：按5%接種量，將培養(yǎng)24h的菌液接入裝有200mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，30℃，培養(yǎng)84h。

1.3.2 最大吸收波長的確定

用離心管量取10mL菌液，60℃水浴20min至菌體失活，取3個稀釋度的菌體用UV-2600紫外分光光度計在200～800nm波長范圍內(nèi)進行掃描，確定最大吸收波長。

1.3.3 標準曲線的繪制

取一離心管置于干燥烘箱中烘干至恒重(m1)，用該離心管取10mL菌液，于60℃水浴20min至菌體失活，失活菌液于離心機中3500r/min、10min，傾去上清液，菌體放入干燥箱中烘干至恒重，自然冷卻后取出稱重(m2)，即可得發(fā)酵液菌體的真實濃度。取與重量法同一菌液，配制2、5、10、20、50倍的系列標樣，以蒸餾水為參比，分別測定吸光度A。繪制A-C標準曲線。

1.3.4 樣品濃度的測定

將待測菌液按1.3.3中相關(guān)步驟操作，測得吸光度，通過標準曲線圖查出菌體濃度值再乘以相應稀釋倍數(shù)。

1.3.5 發(fā)酵液絮凝活性的測定

量取50mL 4g/L 高嶺土懸濁液，加入5mL 1%的氯化鈣溶液作為助凝劑，再加入5mL的菌株發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH至中性，攪拌5min，靜置20min，用UV-2600紫外分光光度計測定550nm波長下，上清液的吸光度值為A1，以超純水處理高嶺土作為對照，測其上清吸光度為A0。

絮凝率=(A0-A1)/A0×100%

1.3.6 豬場廢水的處理

將豬場原水稀釋一倍，混合均勻后，準確量取50mL廢水，分別添加50mL、60mL、70mL、80mL、90mL發(fā)酵菌液，常溫條件下，攪拌1min，靜沉后取上清液，使用UV-2600紫外分光光度計測定900nm波長處的吸光度，計算紅平紅球菌發(fā)酵液絮凝率；使用CR3200 COD消解儀、PhotoLab 7100VIS紫外分光光度計測定上清液COD值，計算廢水COD值及COD去除率；使用濁度儀測定上清液濁度，計算廢水濁度及濁度去除率。計算公式如下：

絮凝率=(A2-A3)/A2×100%

式中：A2—廢水初始吸光度，A3—處理后上清液吸光度。

濁度去除率=(T0-T1)/T0×100%

式中：T0—廢水初始濁度值，T1—處理后上清濁度值，JTU。

COD去除率=(C0-C1)/C0×100%

式中：C0—廢水初始COD值，C1—處理后上清液COD值，mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅平紅球菌產(chǎn)絮凝劑效果分析

經(jīng)紫外-分光光度計掃描后，菌液的吸光度和波長關(guān)系曲線如圖1所示，可以看出紅平紅球菌菌液在200～300nm有較大吸收峰，其中在270nm處吸收峰最大，故在測定菌液發(fā)酵液濃度時選擇的波長為270nm。

紅平紅球菌的生長曲線及其產(chǎn)絮凝劑的曲線如圖2所示。可以看出，菌從試管轉(zhuǎn)移到錐形瓶中培養(yǎng)后，先進入到適應期，生長速度較緩；12～24h，隨著時間的延長，菌的生長進入對數(shù)期，生長速度迅速增快，細菌數(shù)目以幾何數(shù)增加；培養(yǎng)至24h后，菌的生長速度減緩，但總量依然處于增長的階段；48h后菌的生長和死亡速度趨于平衡，進入穩(wěn)定期。絮凝劑的產(chǎn)生量隨著紅平紅球菌的生長逐漸增多，當菌生長進入穩(wěn)定期后，絮凝活性迅速下降，分析可能是因為解絮凝酶所致[5]。為確保發(fā)酵液能發(fā)揮最大的絮凝效果，選擇培養(yǎng)至36h的紅平紅球菌發(fā)酵液處理豬場廢水。

為了解培養(yǎng)36h時菌液濃度，按照1.3.3的操作繪制了紅平紅球菌的A-C標準曲線(圖3)，二者間關(guān)系為y=1.0953x-1.4704，可知，培養(yǎng)36h時菌液濃度為2.78 g/L。

2.2 紅平紅球菌發(fā)酵液投加量對豬場廢水處理效果的影響

取培養(yǎng)至36h的菌液添加至豬場廢水中，處理效果隨菌液投加量的變化如圖4所示。由圖4(a)可以看出，菌液投加量在0～70mL時，豬場廢水絮凝率隨其投加量的增加而提高，當投加量為70mL時絮凝率最高，為40.30%，菌液投加量繼續(xù)增加時，絮凝率開始下降，增至90mL時混合物的吸光度反而高于豬場廢水本身的吸光度。對比圖4(b)發(fā)現(xiàn)，廢水濁度去除率的變化和絮凝率變化相似，當菌液投加量為70mL時，濁度去除率最高，為64.40%。分析原因是菌液中起絮凝效果的高分子物質(zhì)含有多種官能團，其分子上的鏈節(jié)通過電中和作用，與豬場廢水中的膠體懸浮物相結(jié)合，絮凝架橋形成高分子聚合物，由于高分子聚合物具有較強的吸附作用，所以能聚集成更大的絮體而沉淀下來，達到了固液分離的目的。而隨著菌液投加量的增加，多余的高分子物質(zhì)無法與懸浮物結(jié)合，游離于廢水中導致絮凝效果的下降，從而導致了吸光度和濁度的提升。

由圖4(c)可以看出，當菌液投放量為70mL和80mL時，廢水的COD去除率分別為59.14%和63.27%，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)間P=0.120422>0.05，差異不顯著，說明當投放量在70～80mL變化時，菌液對廢水的處理效果相同。當投放量增至90mL時，COD去除率顯著下降。

由此可以發(fā)現(xiàn)，菌液對豬場污水的處理有最佳投加量，低于或超出這個用量都會使絮凝效果下降。查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，絮凝劑的最佳投加量大約是固體顆粒表面吸附大分子化合物達到飽和時一半的吸附量，此時大分子在固體顆粒上架橋幾率最大[6]。

3 結(jié)論

通過對比紅平紅球菌發(fā)酵液投加量對豬場廢水處理效果的數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)，取30℃、LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h的菌液70mL對豬場廢水的處理效果最佳，此時菌液濃度為2.78g/L，絮凝率為40.30%，濁度去除率為64.40%，COD去除率為59.35%。