姜宜妮 梁健 閔建新 曾文泓

摘要?目的：觀察二至丸對絕經后骨質疏松模型鼠的治療作用，并探討其可能的作用機制。方法：將100只雌性SD鼠隨機分為空白組（n=20）和造模組（n=80），造模組大鼠均接受雙側卵巢切除術致骨質疏松模型，將成模大鼠隨機分為模型組、低劑量組、中劑量組及高劑量組，每組20只，造模12 h低劑量組、中劑量組及高劑量組分別予3、6、12 g/kg二至丸灌胃，1次/d。模型組與空白組均予1 mL生理鹽水灌胃，連續(xù)干預8周，比較各組骨組織病理學、組織形態(tài)計量學、骨密度生物力、血脂代謝、組織Wnt/β-catenin通路標志性因子的改變。結果：與空白組比較，模型組脂肪細胞明顯增大，脂肪細胞密度、面積、FLAW、PPARγ顯著增加，外周血TC、TG和LDL-C含量上調（P<0.01）。與模型組比較，二至丸中劑量組和高劑量大鼠上述指標表達下調（P<0.05）;與空白組比較，模型組大鼠BV/TV、Tb.Th，Joint、骨密度、彈性模量、最大載荷、Wnt3a、β-catenin、LRP5表達均減少（P<0.05）;與模型組比較，二至丸中劑量組和高劑量組上述指標表達均顯著增加（P<0.05）。結論：二至丸可明顯改善骨質疏松癥，其作用機制可能與激活Wnt/LRP5/β-catenin通路有關。

關鍵詞?骨質疏松;二至丸;不同劑量;作用機制;Wnt/LRP5/β-catenin通路

Abstract?Objective：To observe the therapeutic effects of Erzhiwan on Postmenopausal Osteoporosis Rat Model and discuss the possible mechanism.Methods：A total of 100 female SD rats were randomly divided into blank group（n=20）and ovariectomy group（n=80），the rats of ovariectomy group were given bilateral ovariectomy to induce osteoporosis and randomly divided into model group（n=20），low-dose group（n=20），middle-dose group（n=20）and high-dose group（n=20）.About 12 h after modeling，the low-dose group，middle-dose group and high-dose group were given Erzhiwan 3 g/kg，6 g/kg，12 g/kg by gastric perfusion per day.The rats of model group and blank group were given normal saline 1 mL by gavage.The rats were treated for 8 weeks.Bone histopathology，bone histomorphometry，biomechanics，blood lipid metabolism and changes of key factor of Wnt/β-cateni pathway were compared.Results：Compared with the blank group，fat cell hypertrophy，density of lipocyte，cell area，F(xiàn)LAW and PPARγ markedly increased，TC、TG and LDL-C in Peripheral blood were down regulated in model group（P<0.01）.Compared with the model group，the above mentioned indexes were markedly decreased in middle-dose group and high-dose group（P<0.05）.Compared with the blank group，BV/TV，Tb.Th，Joint，bone mineral density，elastic modulus，maximum load and expressions of Wnt3a，β-catenin and LRP5 markedly decreased in model group（P<0.05）.Compared with the model group，the above mentioned indexes were markedly decreased in middle-dose group and high-dose group（P<0.05）.Conclusion：Erzhiwan can prevent osteoporosis effectively，the mechanism may be related to the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway.

Keywords?Osteoporosis; Erzhiwan; Different doses; Mechanism; Wnt/β-catenin signaling pathway

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.21.011

中醫(yī)并無“絕經后骨質疏松”的病名記載，根據該病的病因病機及相關臨床癥狀將其歸于“骨痿”“骨痹”“骨枯”等疾病的范疇[1]。中醫(yī)認為腎主骨生髓乃先天之本，《證治準繩》曰：“腎虛不能生肝，肝虛無以養(yǎng)筋，故機關不利”，由此可見“肝腎同源”下先后天之精血的互化及相互作用，共同介導骨骼疾病的轉歸[2]。二至丸是補益肝腎之良方，現(xiàn)代中醫(yī)將其大量運用于治療絕經后骨質疏松[3-5]，但其作用機制目前尚不明了，基于此我們利用大鼠模型，不同劑量二至丸進行干預，旨在探討二至丸治療絕經后骨質疏松的可能機制，為臨床提供客觀依據，具體報道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?雌性SD鼠[購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（許可證號碼：SYXK（湘）2016-0002）]100只，體質量（230±15）g，鼠齡（5±0.5）個月。所有大鼠均飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物實驗室中，許可證號為：SYXK（贛）2014-0008。大鼠接受同批次飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±1）℃，濕度（50±2）%，晝夜12 h/12 h交替，干預操作均在下午14：00-17：00進行。

1.1.2?藥物?二至丸（雷允上藥業(yè)有限公司;國藥準字Z32020882）。

1.1.3?試劑與儀器?水合氯醛溶液（廣州沛瑜生物制品有限公司，貨號：AAPR177-500），總膽固醇（TC）含量檢測試劑盒（武漢博士康生物工程有限公司，貨號：38293），三酰甘油（TG）含量檢測試劑盒（武漢博士康生物工程有限公司，貨號：38222），低密度脂蛋白（LDL-C）含量檢測試劑盒（武漢博士康生物工程有限公司，貨號：19232），高密度脂蛋白（HDL-C）含量檢測試劑盒（武漢博士康生物工程有限公司，貨號：18723），Wnt3a一抗抗體（貨號：23915），LRP5（貨號：57315），DKK1（貨號：46875），RUNX2（貨號：12556s），β-catenin（貨號：12475s），β-actin（貨號：4970T）均購自美國CST公司。雙能X線BMD儀（奧斯托公司，韓國，型號：EXA-3000），電泳制膠架（碧云天生物公司，貨號：E6030），轉膜系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國，貨號：E1130），臺式低溫高速離心機（BECKMAN公司，美國，貨號：64R），酶標自動分析儀（BIO-BAD公司，美國，型號：ELX800），精密電子萬能材料試驗機[大邁儀器（上海）有限公司，貨號：AGS-J]，微計算機斷層掃描設備（micro computed tomography，Micro-CT）（BRUKER microCT公司，德國，型號：SKY SCAN-1172）

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?100只大鼠數字隨機分為空白組、模型組、低劑量組、中劑量組及高劑量組，每組20只，所有大鼠在體質量、鼠齡等方面差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），可進行組間比較。參考文獻[6]中的模型制備方法：所有大鼠適應性喂養(yǎng)7 d，稱重，用10%的水合氯醛溶液（0.2 mL/kg）腹腔內注射麻醉后固定動物于手術臺上，常規(guī)無菌操作，于大鼠下腹部正中切開約1 cm的切口，逐層切開皮膚、皮下組織進入腹腔，行雙側卵巢切除術。先結扎輸卵管與伴行血管再切除卵巢，同法處理對側。最后，用10%青霉素溶液沖洗切口，逐層縫合。術后3 d每只大鼠臀肌注射青霉素[2萬單位/（100 g·d）]預防感染。空白組大鼠開腹后僅切除少量脂肪后縫合。

1.2.2?給藥方法?造模12 h后對大鼠進行藥物干預，各組干預具體如下：1）二至丸低劑量組：在無菌條件下行雙側卵巢摘除術，同時給予二至丸灌胃（3 g/kg），1次/d。2）二至丸中劑量組：在無菌條件下行雙側卵巢摘除術，同時給予二至丸灌胃（6 g/kg），1次/d。3）二至丸高劑量組：在無菌條件下行雙側卵巢摘除術，同時給予二至丸灌胃（12 g/kg），1次/d。4）模型組：在無菌條件下行雙側卵巢摘除術，1 mL生理鹽水灌胃對照觀察。5）空白組：大鼠開腹后僅切除少量脂肪后縫合，1 mL生理鹽水灌胃對照觀察。均連續(xù)干預8周。

1.2.3?檢測指標與方法

1.2.3.1?各組骨組織病理學改變?干預結束后各組隨機選取3只大鼠，充分麻醉后處死，冰上取出右側脛骨，將組織樣本置于4%多聚甲醛中固定24 h，10%EDTA脫鈣42 d后，取大鼠右側脛骨骨骺線下0.5 cm，進行密封脫水[乙醇I（100%），乙醇II（95%），乙醇III（90%），各1 h;乙醇IV（80%），乙醇V（75%），各50 min;乙醇VI（70%），45 min，二甲苯I，二甲苯II，各10 min;二甲苯III，20 min;石蠟I，50 min;石蠟II，1 h;石蠟III，90 min]、石蠟包埋、切片（厚度為5 μm），45 ℃烤片2 h，隨后置于倒置顯微鏡下觀察骨組織病理學變化（骨髓脂肪細胞平均直徑、密度，脂肪空泡面積）。

1.2.3.2?各組骨組織形態(tài)計量學變化?利用microCT對各組大鼠右側脛骨進行骨組織形態(tài)掃描，由此進行計量記錄，從脛骨近心端骨垢線消失處開始掃描，直至脛骨遠心端，掃描厚度10 μm，共掃描70層。應用全自動圖像數字化分析儀對所得圖片分析處理，記錄單位體積骨小梁骨（BV/TV，1/4）、骨小梁平均寬度（Tb.Th）、骨小梁平均間距（FLAW）、骨小梁節(jié)點數（Joint）、相對類骨質量（OV/BV，1/4）、成骨細胞指數（OBI，個/mm）、礦化沉積率（MAR，m/d）、礦化延遲時間（MLT，d）、骨形成率（BFR，m/d）。

1.2.3.3?各組骨密度檢測?干預結束后每組隨機選擇3只大鼠，充分麻醉后處死，取右側股骨，使用雙能X線BMD儀（DXA）檢測樣本的BMD，將解凍后的骨樣本整齊的擺放在檢測床上開始檢測，結果用g/cm2表示。

1.2.3.4?各組大鼠生物力學指標?檢測完BMD的股骨用AGS-J系列精密電子萬能材料試驗機檢測最大載荷和彈性模量。具體方法：將股骨頭凹面朝下，股骨頭端朝前的位置放置于跨距為17 mm的2個支撐點上，壓頭大概在股骨長度中間位置的正上方給標本施加向下10 mm/min的載荷，直至股骨斷裂，最后記錄并計算最大載荷和彈性模量，股骨斷裂前所能承受的最大力為最大載荷，股骨斷裂時所承受的力為斷裂載荷。

1.2.3.5?各組血脂代謝指標?干預結束后每組隨機選擇3只大鼠，充分麻醉后取腹主動脈血，4 ℃，5 000 r/min，離心半徑5 cm條件下離心10 min，取上清液利用全自動生化分析儀檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.2.3.6?骨組織Wnt/β-catenin通路?干預結束后每組隨機選擇3只大鼠，充分麻醉后處死，冰上快速取出右側股骨，加入RIPA蛋白裂解液，勻漿機中勻漿30 min，將樣本置于4 ℃，5 000 r/min，離心半徑5 cm的條件下離心20 min，取上清液（總蛋白溶液），用BCA法進行蛋白濃度檢測并得出各個樣本上樣量，并將樣本加入電泳凝膠內進行跑膠，目的蛋白完全分離后轉膜至PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉進行條帶封閉，2 h后用TBST漂洗條帶，術后加入Wnt3a、LRP5、DKK1、RUNX2、β-catenin一抗抗體（均按照1∶1 000比例稀釋），4 ℃，孵育過夜，TBST漂洗3次，加入羊抗兔二抗（1∶2 000稀釋），室溫下孵育2 h，再次用TBST漂洗條帶1次，滴加ECL顯影液發(fā)光顯影，利用ImageJ軟件分析蛋白相對表達量。

1.3?統(tǒng)計學方法?采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料由（±s）表示，數據符合正態(tài)分布的采用t檢驗，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗，多組采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行統(tǒng)計分析，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結果

2.1?各組骨組織病理學改變?與空白組比較，模型組脂肪細胞明顯增大，脂肪細胞密度和面積顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，二至丸中劑量組和高劑量大鼠脂肪細胞明顯減小，脂肪細胞密度和面積顯著降低（P<0.01）。見表1，圖1。

2.2?各組骨組織形態(tài)計量學變化?與空白組比較，模型組大鼠BV/TV、Tb.Th，Joint均減少（P<0.05），F(xiàn)LAW明顯增加（P<0.05）;與模型組比較，二至丸中劑量組和高劑量靜力學參數BV/TV、Tb.Th，Joint均顯著增加（P<0.05），而FLAW明顯減少（P<0.05）。見表2。

2.3?各組骨密度及生物力學比較?與空白組比較，模型組骨密度顯著降低（P<0.05），與模型組比較，二至丸中劑量組和高劑量組大鼠BMD顯著增高（P<0.01）;與空白組比較，模型組彈性模量、最大載荷顯著降低（P<0.01），與模型組比較，二至丸中劑量組和高劑量大鼠彈性模量、最大載荷顯著增高（P<0.01）。見圖2，表3。

2.4?各組血脂代謝指標比較?與空白組比較，模型組大鼠外周血TC、TG和LDL-C含量上調，HDL-C表達減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與模型組比較，二至丸中劑量組和高劑量TC、TG和LDL-C含量降低（P<0.05），HDL-C表達上調（P<0.05）。見表4。

2.5?各組骨組織Wnt/β-catenin通路改變?與空白組比較，模型組Wnt3a、β-catenin、LRP5表達顯著降低（P<0.05），二至丸中劑量組和高劑量Wnt3a、β-catenin、PPARγ表達明顯上調（P<0.05）。見圖3。

3?討論

大量文獻資料顯示Wnt/β-catenin通路是刺激成骨細胞增殖、成骨分化，抑制其成脂分化的重要通路，Wnt3a是Wnt信號通路重要的因子，Wnt3a與細胞膜上受體卷曲蛋白（Frizzled）結合后啟動該通路，由此將細胞內的蓬亂蛋白激活，促使其與體軸發(fā)育抑制因子產生互作效應，抑制了β-catenin的磷酸化，由此導致β-catenin大量堆積與胞質內，并移位至細胞核，進一步啟動下游靶因子。LRP5是該通路重要的下游靶因子，可促進骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞，激活細胞外基質磷酸化糖蛋白（MEPE）基因啟動子，從而誘發(fā)細胞外基質（ECM）礦化的發(fā)生[7-10]。有數據顯示在胚胎發(fā)育早期，隨著Wnt/β-catenin通路被抑制BMSCs成脂分化的程度越明顯，從而引起骨量下降和骨密度減少，導致骨質疏松等疾病的發(fā)生發(fā)展[11]。由此可見Wnt3a、β-catenin、LRP5是關鍵因子，該3個指標的表達高低是Wnt/β-catenin通路激活狀態(tài)的直接體現(xiàn)。Wnt/β-catenin通路已然成為中醫(yī)藥領域學者研究骨質疏松的熱點，其相關性亦被不斷證實。PPARγ是調控脂代謝的重要因子，其在脂肪組織有高表達，是脂肪形成的核心基因，主要調控脂肪細胞分化過程[12]。LPL是介導脂代謝過程的活性酶，在PPARγ調控下LPL可將機體的三酰甘油分解成甘油及游離脂肪酸，有數據顯示上調PPARγ的表達及活性可驅動成骨細胞發(fā)生成脂分化，隨著Wnt/β-catenin信號通路被抑制，最終將進一步加劇骨質流失[13]，由此我們認為PPARγ即可促使成骨細胞成脂分化，亦可抑制其成骨分化，從而誘發(fā)骨質疏松的發(fā)生發(fā)展。LRP5是低密度脂蛋白受體，是調控成骨細胞分化的重要因子，LRP5是Wnt/β-catenin信號通路的輔助受體，LRP5的表達缺失可導致Wnt/β-catenin信號通路傳導出現(xiàn)障礙，從而影響骨骼系統(tǒng)的調控。本研究中我們發(fā)現(xiàn);模型組脂肪細胞明顯增大，脂肪細胞密度、面積、FLAW顯著增加，外周血TC、TG和LDL-C、LRP含量上調，BV/TV、Tb.Th，Joint、骨密度、彈性模量、最大載荷、Wnt3a、β-catenin、LRP5表達均減少。由此可見骨質疏松發(fā)生時骨密度下降，骨骼彈性、承載力下降，Wnt/β-catenin信號通路受抑制，由此我們認為上調LRP5表達，激活Wnt/β-catenin信號通路，抑制PPARγ將是有效改善骨質疏松的有效途徑。

絕經后骨質疏松是女性常見疾病，歸屬于中醫(yī)“骨痿”“骨痹”“骨枯”等疾病的范疇。腎乃先天之本，主骨生髓，《醫(yī)精經義》曰云：“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，故骨者，腎之合也，髓者，精之所生也，精足則髓足，髓在骨內，髓足則骨強”，由此骨質的強健取決于腎精的盛衰[14-15]。《黃帝內經》亦云“年四十而陰氣自半”。女性至更年期，腎氣漸衰，精虧血少，則腎陰更顯不足，如加之肝火、心火之暗耗，故圍絕經期婦女以腎陰虛居多，因此補益肝腎是治療絕經后骨質疏松的關鍵。二至丸由女貞子、墨旱蓮2味藥組成，以《醫(yī)方集解》記載者為常用方，有益肝腎、補陰血、壯筋骨的療效[16]，本研究將不同劑量的二至丸用于干預骨質疏松模型鼠，結果顯示隨著劑量的增加，二至丸在增加模型鼠骨密度，改善脂代謝方面療效越顯著，且隨著濃度的增加，大鼠Wnt3a、β-catenin、LRP5表達越明顯，PPARγ表達越下調。

由此我們認為6 g/kg和12 g/kg二至丸均可激活Wnt/β-catenin信號通路而抑制骨質疏松的發(fā)展，但是骨髓內微環(huán)境復雜多樣，僅從一條通路探討二至丸的作用機制尚不夠全面，下階段將進一步研究，深入探討二至丸治療骨質疏松的可能機制。

參考文獻

[1]梁偉喬，鐘誠，李宇明.骨質疏松癥的中醫(yī)病因病機認識與治療進展[J].中國骨質疏松雜志，2020，26（1）：135-139.

[2]袁麗麗.補腎健脾方對卵巢切除大鼠骨質疏松癥的治療作用及機制初探[D].北京：中國中醫(yī)科學院，2019.

[3]李冠慧.絕經后骨質疏松癥腎陰虛證的病理機制及補腎滋陰法干預研究[D].福州：福建中醫(yī)藥大學，2018.

[4]梁文娜，李西海，胡柳，等.二至丸抑制絕經后骨質疏松大鼠骨代謝紊亂的作用機制研究[J].中醫(yī)正骨，2017，29（11）：1-7，14.

[5]劉振濤，張怡元，林煜，等.二至丸促進圍絕經期婦女成骨細胞增殖的分子機制[J].中國骨質疏松雜志，2017，23（4）：524-529.

[6]陳朝祥，周淑平，張衛(wèi)，等.伊班膦酸鈉對卵巢切除所致骨質疏松模型大鼠的影響及機制[J].中國組織工程研究，2020，24（17）：2625-2629.

[7]李濤，吳山，范志勇，等.基于Wnt/β-catenin通路中醫(yī)藥療法治療骨相關疾病研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2020，22（4）：117-121.

[8]許燦宏，陳躍平，章曉云.成骨信號通路在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中的作用[J].中國組織工程研究，2020，24（14）：2235-2242.

[9]葛磊.VitD調控Wnt/β-catenin信號通路對關節(jié)軟骨細胞的作用機制研究[D].濟南：山東大學，2019.

[10]趙常紅，李世昌，孫朋.不同運動對生長期大鼠Wnt/β-catenin信號及軟骨內成骨的影響[J].天津體育學院學報，2019，34（3）：238-242，263.

[11]李亞芳，喬義強.NF-κB與Wnt/β-catenin信號通路在調控成骨方面的研究進展[J].河南醫(yī)學研究，2019，28（4）：767-769.

[12]劉亦斌，李小軍，劉強，等.Wnt/β-catenin信號通路與自噬在骨關節(jié)炎軟骨細胞中的相互作用[J].寧夏醫(yī)科大學學報，2019，41（4）：325-331.

[13]謝晚晴，鄭洪新.基于Wnt/β-catenin信號通路的中醫(yī)藥干預骨關節(jié)炎的研究進展[J].中國骨質疏松雜志，2018，24（5）：664-670.

[14]梁桂平.絕經后骨關節(jié)炎與骨代謝的相關性及中醫(yī)證型分布研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2019.

[15]賴培茜.絕經后原發(fā)性骨質疏松癥影響因素的分析研究[D].廣州：廣東藥科大學，2019.

[16]程敏.二至丸及其組方藥物防治骨質疏松與作用機制研究[D].西安：西北大學，2012.

（2020-04-30收稿?責任編輯：王明）