陳 龍,王冬梅,于愛華,李 波

(黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司,黑龍江佳木斯 154000)

大豆中蛋白質(zhì)的含量在40%左右,其氨基酸組成及比例可以與牛奶蛋白質(zhì)相媲美,含有人體必需的八種氨基酸組成[1],與其他植物蛋白相比，大豆蛋白屬于營養(yǎng)價值十分豐富的完全蛋白質(zhì)。近年來,大豆制品在新技術的改進下,其口感和功能得到了改善。但是隨著大豆及其制品的廣泛應用,其大豆中含有的致敏性蛋白成分越來越受到人們的關注。目前的研究表明,β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、GlymBd30K(P34)和GlymBd28K是主要的大豆致敏蛋白,致敏蛋白是一種糖蛋白,糖基化位點位于成熟蛋白第170位天冬酰胺處,多糖組成為甘露糖、木糖等。P34中含有3對二硫鍵,主要由a-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)組成[2]。

大豆中的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)在加工過程中會遭受不同程度的破壞,因此,利用加工方法必然能降低或消除其致敏性。Magishi等[3]研究表明,高溫條件能夠破壞大豆球蛋白的三維空間結(jié)構(gòu),進而改變蛋白的致敏性。然而也有研究表明,熱處理會促使致敏性的增強,原因是熱處理使得致敏原內(nèi)部暴露了更多的抗原表位[4-6]。Hill等[7]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)半乳甘露聚糖修飾后,可以有效降低致敏性。Frias[8]利用枯草芽孢桿菌、米根霉和米曲霉,以大豆作為底物進行固態(tài)發(fā)酵,其致敏性降低了66%。

生物解離技術是一種新型的生物技術,其安全高效,廣泛應用于各種植物油脂的提取和植物蛋白質(zhì)的改性中。鄭環(huán)宇等[9]研究采用超高壓結(jié)合生物解離工藝,有效降低了大豆分離蛋白P34的致敏性。但生物解離技術應用于豆奶粉中,研究豆乳粉的致敏性及結(jié)構(gòu)的變化鮮有報道。因此,本文采用生物解離的方法,研究其對豆奶粉致敏性、分子量及氨基酸組成的影響,并進一步分析脫敏豆奶粉的結(jié)構(gòu)特性的變化。對擴大豆奶粉的應用領域及提升我國大豆產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑河43大豆 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院黑河農(nóng)科所;Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶(50萬U/g) 諾維信(中國)生物技術有限公司;丙烯酰胺(Acr)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇、四甲基乙二胺(TEMED)、考馬斯亮藍R-250、甘氨酸(Gly) 美國Sigma公司;美國磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉鹽酸 天津市耀華化工廠;氫氧化鈉 天津市天大化學試劑廠;十二烷基硫酸鈉(SDS) 博士德生物有限公司;麥芽糖漿 山東西王糖業(yè)有限公司;消泡劑 美博食品科技有限公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JE-502電子天平 上海浦春計量儀器有限公司;FA2004電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;HH-4電熱恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠;PT-3502G型酶標儀、96孔酶標儀 北京普天新橋技術有限公司;DHG-9240A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;PHS-25C數(shù)字酸度計 上海大普儀器有限公司;電子萬用爐 杭州錢江儀器設備有限公司;GJJ型超高壓均質(zhì)機 美國PHD科技有限公司;HYP-1020型智能消化爐 上海纖檢儀器有限公司;Mini電泳儀電泳槽 美國伯樂。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆基礎理化指標的測定 水分測定GB/T 5009.3-2016;蛋白質(zhì)測定GB/T 5009.5-2016;脂肪測定GB/T 5009.6-2016;灰分測定GB/T 5009.4-2016;膳食纖維測定GB 5009.88-2014;可利用碳水化合物參照GB 28050-2011,可利用碳水化合物=1-蛋白質(zhì)含量-水分含量-脂肪含量-灰分含量-膳食纖維含量。

1.2.2 生物解離豆奶粉的制備 大豆生物解離豆奶粉制備流程如下:

大豆→清理→浸泡(6 h)→磨漿(干豆∶水=1∶6)→過濾(過200目篩布)→豆奶→生物解離(2.0‰加酶量,Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶,V/V),50 ℃,pH=8,時間0、10、20、30 min)→滅酶(沸水浴10 min)→冷卻→調(diào)配濃縮(pH=7.0～7.2)→均質(zhì)(10 MPa,5 min)→噴霧干燥(進口溫度140～160 ℃,出口溫度85～90 ℃)→生物解離豆奶粉

1.2.3 豆奶粉中過敏原含量的測定 過敏原的提取:稱取1 g脫脂豆奶粉于離心管中,加入19 mL的0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液,在室溫條件下?lián)u床振蕩12 h,3000×g離心20 min,取上清,用0.45 μm膜過濾,再用緩沖液稀釋10倍,得待試樣。

采用大豆過敏原酶聯(lián)免疫試劑盒測定大豆過敏原含量:用酶標儀在450 nm波長處測定樣品的吸光度,利用標準曲線確定測試樣品中過敏原的含量。標準曲線方程:Y=0.0456X+0.0387,R2=0.997。

1.2.4 豆奶粉中蛋白質(zhì)分子量測定 參照黃蘇[10]的方法,稱取1 μL的樣品置于樣品靶位上,再移取1 μL CHCA基質(zhì)溶液點置于對應的靶位上室溫干燥,校準標準品以同樣的方法置于與樣品靶為相鄰的靶位上。在10000～100000 m/z的一級質(zhì)譜范圍內(nèi)進行圖像采集。

1.2.5 豆奶粉中蛋白質(zhì)水解度測定 參考Nielsen等[11]的方法,即鄰苯二甲醛(o-phthaldialdehyde,OPA)法。蛋白質(zhì)水解度按下式計算:

式中:Serine-NH2為meq serine NH2/g蛋白;V為樣品體積(L);X為樣品質(zhì)量(g);P為樣品中蛋白含量(%);h為水解的肽鍵數(shù);htot為總肽鍵數(shù)(大豆htot為7.8);α為0.970;β為0.342。

1.2.6 豆奶粉中氨基酸組成測定 采用氨基酸全自動分析儀測定樣品中氨基酸組成,取一定量樣品于試管中,加入適量濃度為6 mol/L的鹽酸并密封試管,將試管置于110 ℃烘箱中水解22 h,水解結(jié)束后用孔徑為0.45 μm濾膜過濾,將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容。取1 mL溶液進行濃縮、復溶,重復操作3次后以50 μL的進樣量進行過濾進樣。測定各樣品中各種氨基酸含量[12]。

1.2.7 生物解離豆奶粉原子力顯微鏡觀察 利用原子力顯微鏡觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。將制備的樣品均勻分散在載玻片的表面。掃描頻率為1.0 Hz,掃描區(qū)域為5 μm×5 μm和1 μm×1 μm之間,使用Nano Scope Analysis 1.5(Veeco,USA)用于AFM圖像分析[13]。

1.2.8 拉曼光譜測定 樣品采用BRAVO手持型拉曼光譜掃描儀,掃描波長為785 nm處、掃描功率0.3 W、在400～2000 cm-1的范圍內(nèi)掃描1 min,共掃描4次。將苯丙氨酸的吸收峰值作為歸一因子(1003 cm-1),得樣品蛋白質(zhì)的拉曼譜圖。采用ACD Labs V12軟件進行譜圖基線校正、譜峰歸屬查找[14]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆基礎理化指標

黑河43大豆籽粒的水分含量為9.4%±0.2%,在糧食儲藏安全水分以下;蛋白質(zhì)含量為41.0%±0.1%,屬于高蛋白型大豆;脂肪含量16.5%±0.2%,灰分含量5.4%±0.1%,膳食纖維含量5.0%±0.3%,碳水化合物含量為22.7%±0.4%。

2.2 生物解離對豆奶粉致敏性的影響

由圖1可知,隨著生物解離時間的增加,豆奶粉中過敏原含量呈先降低后趨于平緩的趨勢。在生物解離10 min時豆奶粉過敏原含量顯著降低(P<0.05),與未經(jīng)生物解離的豆奶粉相比,過敏原含量降低了20.7%。在生物解離作用時間20和30 min時,豆奶粉中致敏原含量變化不顯著(P>0.05)。進一步說明了適當?shù)纳锝怆x時間可有效降低豆奶粉中的致敏原含量,可能是由于豆奶粉在堿性蛋白酶的作用下,大分子的致敏性蛋白降解為致敏性較低的小分子肽,從而降低了豆奶粉的致敏性。這與Meinlschmidt等[15]研究結(jié)果一致。

圖1 生物解離時間對過敏原含量的影響

2.3 生物解離對豆奶粉中蛋白質(zhì)分子量的影響

生物解離時間對豆奶粉中蛋白質(zhì)分子量影響的分布如圖2所示,豆奶粉中的蛋白質(zhì)分子量均在5 kDa以上,經(jīng)生物解離作用后,大分子的蛋白質(zhì)變?yōu)樾》肿拥牡鞍踪|(zhì),分子量不斷減小。在生物解離作用時間為10 min時,蛋白質(zhì)分子量在2～4 kDa的含量最高。在生物解離30 min時,0～2 kDa的小分子肽含量最高,隨著生物解離時間的不斷增加,肽含量隨之增加。分子量的變化進一步說明了豆奶粉中蛋白質(zhì)致敏性降低與生物解離蛋白質(zhì)分子量的降低有關。

圖2 生物解離時間對豆奶粉中蛋白質(zhì)分子量影響

2.4 生物解離對豆奶粉中蛋白質(zhì)水解度的影響

蛋白質(zhì)的水解度是指蛋白質(zhì)分子經(jīng)水解后,斷裂的肽鍵數(shù)與蛋白質(zhì)分子中總肽鍵數(shù)的比值[16]。在生物解離作用下,豆奶粉的蛋白質(zhì)分子被水解后,其功能性質(zhì)會發(fā)生改變,并對豆奶粉的溶解性及穩(wěn)定性等產(chǎn)生影響[17]。生物解離時間對豆奶粉中蛋白質(zhì)水解度的影響如圖3所示,隨著生物解離時間的增加,蛋白質(zhì)的水解度不斷增加。在生物解離作用時間為10 min時,蛋白質(zhì)的水解度變化顯著,生物解離作用時間20與30 min時,蛋白質(zhì)的水解度變化不顯著。豆奶粉中蛋白質(zhì)經(jīng)生物解離后,極性集團與小分子肽增加,親水性增強,從而利于提高豆奶粉的溶解性。

圖3 生物解離時間對豆奶粉中蛋白質(zhì)水解度的影響

2.5 生物解離對豆奶粉中氨基酸組成的影響

不同生物解離時間條件下,豆奶粉中氨基酸含量如表1所示,經(jīng)生物解離后,豆奶粉蛋白質(zhì)中Met含量顯著降低,而Thr、Gly、Cys、Val、Ile呈升高的趨勢。這是由于在生物解離過程中,蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了一定程度的變化,導致一些氨基酸側(cè)鏈基團從蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中暴露出來,生物解離程度越深,氨基酸暴露的含量就越多[18],而帶有苯環(huán)的芳香族氨基酸多是疏水性氨基酸,因此生物解離導致了疏水性氨基酸百分比增加[19]。另外,Fischer等[20]研究表明生物解離后,疏水性氨基酸引起的疏水性相互作用對肽聚集有很大貢獻,使蛋白質(zhì)的肽鏈越來越短,其受到的空間阻礙越來越弱,這時肽鏈更容易通過疏水相互作用發(fā)生聚集,從而引起部分疏水性的降低。

表1 生物解離對豆奶粉中氨基酸組成的影響

2.6 生物解離豆奶粉原子力顯微鏡觀察

原子力顯微鏡用以觀察樣品中蛋白的形貌特征,并觀察蛋白質(zhì)是分散或聚集狀態(tài)[21]。由圖4可知,在生物解離0和10 min的條件下,樣品形態(tài)明顯,表面不光滑,呈現(xiàn)出了分子聚集現(xiàn)象,并呈現(xiàn)α亞基結(jié)構(gòu)的花骨形和α′亞基或β亞基結(jié)構(gòu)的蟲形。比較發(fā)現(xiàn),在生物解離20 min的條件下樣品表面較平滑,以單個分子狀態(tài)存在,未出現(xiàn)7S的亞基的聚集體。在生物解離30 min條件下,再次呈現(xiàn)了分子的聚集現(xiàn)象。

圖4 生物解離時間對豆奶粉中蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的影響

2.7 生物解離豆奶粉拉曼光譜分析

拉曼光譜是研究分子相互作用的一種有效的手段,因此常采用拉曼光譜法分析蛋白中氨基酸及二硫鍵構(gòu)象的變化。在拉曼光譜測定中,譜線強度與散射中心(化學鍵和基團)數(shù)目為正比例關系[22-23]。因此,依據(jù)樣品拉曼譜線強度可以判斷樣品中特定化學鍵或基團的變化程度大小,譜線強度變小表明樣品中蛋白質(zhì)對應的基團或化學鍵受到破壞,含量變少。而譜線的偏移說明對應的化學鍵或基團發(fā)生了變化[24-25]。

生物解離不同時間下豆奶粉蛋白質(zhì)的拉曼圖譜分析如圖5所示。隨著生物解離時間的增加,豆奶粉中蛋白的譜線強度變?nèi)?表明生物解離程度的加深,破壞了蛋白質(zhì)中的基團或化學鍵。但蛋白質(zhì)的譜線并未發(fā)生偏移,說明對應的化學鍵與基團并未發(fā)生變化。在拉曼光譜中500～550 cm-1處一般作為二硫鍵的譜帶。此二硫鍵譜帶區(qū)間上位移和拉曼振動模式的關系是:500～510 cm-1處為gauche-gauche-gauche(g-g-g)模式,515～525 cm-1gauche-gauche-trans(g-g-t)模式,535～545 cm-1為trans-gauche-trans(t-g-t)模式,經(jīng)生物解離后豆奶粉蛋白質(zhì)的分子內(nèi)二硫鍵構(gòu)型為g-g-g構(gòu)型[26-28]。

圖5 生物解離時間對豆奶粉中蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的影響

3 結(jié)論

豆奶粉因其營養(yǎng)豐富,口感醇厚,受到廣大消費者的喜愛,但豆奶粉的致敏性限制了部分人群的食用,本研究表明生物解離技術可有效降低豆奶粉中蛋白質(zhì)的致敏性,經(jīng)生物解離10 min后,豆奶粉的致敏性顯著降低了20.7%。蛋白質(zhì)的水解度增加,并產(chǎn)生了分子量小于1.0 kDa的大豆多肽。拉曼光譜分析顯示蛋白質(zhì)分子內(nèi)的化學鍵及基團受到了一定程度的破壞。對于在生物解離過程中具體被破壞、暴露或掩埋的抗原表位有待進一步研究。對進一步揭示不同處理方式對大豆及其制品致敏性的影響機理,開發(fā)低致敏性或無致敏性的大豆及其制品具有重要意義。