HPLC多成分測(cè)定及主成分分析法對(duì)不同產(chǎn)地鮮地黃質(zhì)量評(píng)價(jià)

李詢　董誠(chéng)明　齊大明　李曼　邢冰　侯楊威

摘要：以采自河北、山西、河南等省的35份鮮地黃為試驗(yàn)材料，以浸出物、多糖、梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷為考察指標(biāo)，采用HPLC多成分同時(shí)測(cè)定與主成分分析法，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地鮮地黃品質(zhì)差異。結(jié)果表明，3個(gè)產(chǎn)地的35批鮮地黃品質(zhì)差異明顯，河南省的樣品地黃苷A、毛蕊花糖苷含量較高，河北省的樣品地黃苷D含量較高，山西省的樣品多糖含量較高，35份鮮地黃樣品的綜合主成分值范圍為-0.647 9～2.974 1，河南產(chǎn)區(qū)的主成分分析均值最高，為0.306 8，其次是河北省，為-0.183 7，再次是山西，為-0.281 2。不同產(chǎn)區(qū)地黃品質(zhì)存在差異，綜合分析以河南產(chǎn)區(qū)為佳，HPLC多成分同時(shí)測(cè)定與主成分分析相結(jié)合可以綜合評(píng)價(jià)鮮地黃的質(zhì)量，為地黃原藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供便捷有效的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鮮地黃;HPLC;浸出物;多糖;環(huán)烯醚萜苷;苯乙醇苷;主成分分析

中圖分類號(hào)： S567.23+9.01;R284.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）19-0225-05

收稿日期：2019-12-19

基金項(xiàng)目：河南省重大科技專項(xiàng)（編號(hào)：171100310500）;國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（編號(hào)：ZYBZH-Y-HEN-18）;國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)（編號(hào)：14104584-2018-1）。

作者簡(jiǎn)介：李 詢（1994—），女，河南鄭州人，碩士研究生，從事生藥學(xué)研究。E-mail：1025552320@qq.com。

通信作者：董誠(chéng)明，教授，從事中藥材規(guī)劃范種植技術(shù)研究。E-mail：dcm371@hactcm.edu.cn。

地黃（Rehmannia glutinosa Libosch.）為玄參科多年生草本植物，主產(chǎn)于河南省、河北省、山西省、東北等地，以古懷慶府一帶的懷慶地黃栽培歷史最長(zhǎng)，被稱為懷地黃，氣候、土壤等因素造成各地地黃有效成分有所差異。地黃作為臨床常用藥，質(zhì)量控制至關(guān)重要，地黃中含有環(huán)烯醚萜苷類及苯乙醇苷類等主要成分，具有利尿、降糖、滋陰補(bǔ)血[1-3]，調(diào)節(jié)免疫，抗炎、抗衰老等作用[4-7]。2015年版《中國(guó)藥典》中以梓醇和毛蕊花糖苷的含量作為質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)，難以全面考察其質(zhì)量。

近年來(lái)地黃在山西、河南、河北等省種植較多，為研究各產(chǎn)地鮮地黃的質(zhì)量差異，本研究選取河南、山西、河北3地的鮮地黃（北京3號(hào)）為研究對(duì)象，以浸出物、多糖及地黃中5種苷類物質(zhì)的含量為考察指標(biāo)，用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷含量。建立便捷、可靠的方法同時(shí)測(cè)定鮮地黃中多種成分含量，分析各產(chǎn)地地黃質(zhì)量差異，可為建立鮮地黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)體系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

試驗(yàn)樣品由筆者在不同產(chǎn)地采集，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定，為玄參科植物地黃北京3號(hào)的塊根，55 ℃低溫烘干打粉后供本試驗(yàn)研究使用。樣品信息見(jiàn)表1。

1.2 浸出物、多糖含量檢測(cè)

浸出物按照《中國(guó)藥典》2015年版冷浸法測(cè)定;多糖含量按照苯酚-硫酸法測(cè)定[8]。

1.3 梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷含量測(cè)定

1.3.1 色譜條件

色譜柱為安捷倫ZORbAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5-Micron），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min，1.3%A;5 min，1.5%A;6 min，3%A;14 min，3%;15 min，4%A;20 min，4%A;25 min，20%A;40 min，20%A）;體積流量為1 mL/min;柱溫35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)0～20 min：203 nm，21～35 min：334 nm;進(jìn)樣量20 μL（圖1）。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精確稱取梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷對(duì)照品，加超純水配置成濃度分別為2.4、0.3、0.2、0.2、0.3 mg/mL 的混標(biāo)溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 精確稱取生地黃樣品粉末0.8 g，置于具塞平底燒瓶中，加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取1 h，放至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，精確量取續(xù)濾液20 mL，濃縮近干，殘?jiān)盟芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，臨用前用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 線性關(guān)系考察 取“1.3.2”節(jié)中制備的對(duì)照品溶液，記為溶液1，依次稀釋1.25、2.00、4.00、10.00、20.00、40.00倍，記為混標(biāo)溶液2～7（溶液7僅用于毛蕊花糖苷的線性范圍考察）。按照“1.3.1”節(jié)的方法進(jìn)樣，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程見(jiàn)表2。

1.4.2 精密度試驗(yàn) 精確吸取同一鮮地黃供試品溶液，按照“1.3.1”節(jié)的色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.62%、1.75%、1.46%、1.74%、0.20%，表明儀器精密度良好。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精確稱取同一批次的鮮地黃粉末6份，按“1.3.3”節(jié)方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”節(jié)方法進(jìn)行色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。得梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷的RSD分別為1.88%、1.27%、1.49%、0.68%、1.73%，表明此方法重復(fù)性良好。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精確吸取同一鮮地黃供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 h，按照“1.3.1”節(jié)的色譜條件測(cè)定。結(jié)果梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.47%、0.31%、1.31%、1.61%、0.88%，表明室溫條件下供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.4.5 加樣回收率 精確稱取已測(cè)定含量的25號(hào)樣品粉末6份，每份0.2 g，分別精確加入梓醇、地黃苷D、地黃苷A、益母草苷及毛蕊花糖苷對(duì)照品6.51、0.12、0.37、0.72、0.32 mg，按照“1.3.3”節(jié)的方法制備供試品溶液（所有試劑均減半），按照“1.3.1”節(jié)的色譜條件測(cè)定，結(jié)果顯示平均加樣回收率分別為99.87%、101.78%、96.14%、97.69%、102.57%，RSD值分別為0.96%、1.23%、1.35%、0.58%、1.03%，表明此方法能夠很好地提取出指標(biāo)性成分。

1.4.6 樣品測(cè)定

35份鮮地黃樣品按“1.3.3”節(jié)進(jìn)行制備，以“1.3.1”節(jié)條件測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

按照“1.2”“1.3”節(jié)所述檢測(cè)35份樣品中考察指標(biāo)的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。浸出物含量最高的是N21，多糖含量最高的是X13，梓醇含量最高的是N22，毛蕊花糖苷含量最高的是N22，地黃苷D含量最高的是B5，地黃苷A含量最高的是N22，益母草苷含量最高的是N33。

運(yùn)用主成分分析法，浸出物、梓醇、地黃苷D、地黃苷A、益母草苷、毛蕊花糖苷、多糖含量為指標(biāo)性成分，對(duì)35份地黃樣品中的百分含量進(jìn)行綜合分析。根據(jù)降維結(jié)果，共挑選出3個(gè)主成分PC1、PC2、PC3，特征值分別為2.674、1.372、0.887。累計(jì)貢獻(xiàn)值為70.476%，具有代表性，可以用來(lái)評(píng)價(jià)地黃質(zhì)量。綜合主成分值可以反映不同地黃的質(zhì)量，得分越高表示成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，地黃質(zhì)量越好。由表4可知，35份鮮地黃樣品的綜合成分值在-0.647 9～2.974 1，表明不同產(chǎn)地鮮地黃的成分量范圍。綜合值排序可以看出N22號(hào)即河南省溫縣趙堡鎮(zhèn)趙堡村的鮮地黃質(zhì)量最好，X13號(hào)即山西省永濟(jì)市韓陽(yáng)鎮(zhèn)韓陽(yáng)村的鮮地黃質(zhì)量最差，河南省、河北省、陜西省鮮地黃指標(biāo)性成分主成分分析均值分別為0.306 8、-0.183 8、-0.281 2，河南各地的平均分最高，山西產(chǎn)地的平均分最低。

3 討論

本研究建立了鮮地黃中5種化學(xué)成分同時(shí)測(cè)定的HPLC方法，該法高效、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，能客觀準(zhǔn)確地反映出不同產(chǎn)地鮮地黃化學(xué)成分含量的差異，對(duì)于評(píng)價(jià)鮮地黃質(zhì)量?jī)?yōu)劣具有一定的參考價(jià)值。多指標(biāo)測(cè)定有利于更加全面地考察鮮地黃的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)合浸出物、多糖含量有利于更加全面、客觀評(píng)價(jià)鮮地黃藥材的質(zhì)量。

本研究采用主成分分析法，通過(guò)變量之間的相關(guān)性減少變量將數(shù)據(jù)降維，將本試驗(yàn)所得的7個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合全面評(píng)價(jià)，從而有效地反映不同指標(biāo)與鮮地黃質(zhì)量的關(guān)系，更加全面客觀地評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地地黃品質(zhì)差異。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地鮮地黃差異明顯，河南省的樣品中地黃苷A、毛蕊花糖苷含量較高，河北省的樣品地黃苷D含量較高，山西省的樣品多糖含量較高，與各地環(huán)境氣候及人為因素有關(guān)。經(jīng)主成分分析，得出各產(chǎn)地鮮地黃綜合質(zhì)量為河南優(yōu)于河北優(yōu)于山西，這與地黃道地性相符，河北地區(qū)所用地黃種栽基本來(lái)源于河南省，因此質(zhì)量?jī)?yōu)于山西省。

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