宋秋佳 盧文麗 潘志強(qiáng)

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 （上海，201203）

原發(fā)性肝癌（PLC）是我國難治性惡性腫瘤，病死率高［1］。PLC的治療，目前仍以早期局部手術(shù)切除作為首選方案。但是，所有促進(jìn)早期手術(shù)得以實(shí)現(xiàn)的努力和各種療法的實(shí)施，使得術(shù)后1、3、5年生存率已接近高限［2］。此外，國際上多采納巴塞羅那臨床肝癌分期標(biāo)準(zhǔn)，對B期（單發(fā)或多發(fā)的大腫瘤）推薦經(jīng)導(dǎo)管肝動脈化療栓塞（TACE），對C期（伴大血管／膽管癌栓）僅推薦多靶向性藥物索拉非尼［3，4］。有研究表明，我國約80%的肝癌患者都不同程度地接受過中醫(yī)藥治療［5，6］。而中醫(yī)藥在預(yù)防和降低肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率、改善癥狀、提高生存質(zhì)量，甚至延長患者生存期等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢［5，6］。已有隨機(jī)對照、多中心的臨床試驗(yàn)證明，服用相應(yīng)的中藥現(xiàn)代制劑可顯著降低肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［7］。中國臨床腫瘤學(xué)會針對PLC診療指南最新版（2018Ⅴ1），晚期一線、二線策略的Ⅰ級專家推薦中，也明確指出傳統(tǒng)中醫(yī)藥辨證論治或在此基礎(chǔ)上開發(fā)出的現(xiàn)代中藥制劑存在使用空間［8］。因此，如果能從細(xì)胞、分子水平明確中醫(yī)藥抑制肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，將有助于發(fā)揮中醫(yī)藥在肝癌治療中的作用，促進(jìn)臨床療效的提升。

本文主要關(guān)注中藥提取物（復(fù)方及單味藥，以及少量提取物的組合）抑制肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及其研究進(jìn)展，暫不含中藥單體。文獻(xiàn)主要源自Pubmed Medline數(shù)據(jù)庫，以Hepatocellular、Carcinoma／Liver cancer、Extract／herb／decoction／formulation、Metastasis／invasion／migration、Herbal formula／decoction／recipe等作為關(guān)鍵詞，去除重復(fù)及與單體有關(guān)的研究，去除臨床研究，最終入選文獻(xiàn)39篇。

在入選文獻(xiàn)的分類上，肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，中醫(yī)復(fù)方、單味藥提取物所開展的抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移作用研究，主要是圍繞如下環(huán)節(jié)展開，即基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）活性變化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、經(jīng)典信號通路調(diào)控、調(diào)節(jié)免疫、腫瘤血管生成和微環(huán)境和其他等等。因此，本文從以上角度進(jìn)行分類、梳理，同時(shí)兼顧復(fù)方、單味藥，體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)等亞分類。

1 與MMPs等相關(guān)

1.1 復(fù)方 Yang等［9］采用抑瘤飲（由黃芪2 g、靈芝1 g、杏仁1 g、白花蛇舌草3 g、附子2 g、甘草2 g、西洋參1 g和桔梗1 g組成）水提物開展的體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)抑瘤飲能顯著抑制SMMC7721肝癌細(xì)胞的增殖，MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)降低伴隨著細(xì)胞遷移和侵襲抑制。

1.2 單味藥

1.2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 Cheng等［10］采用澤漆的乙酸乙酯提取物（EAE）作用于裸鼠肝細(xì)胞癌（HCC）異種移植瘤模型，持續(xù)30d。結(jié)果顯示與對照組比較，隨著EAE濃度的增加（50、100、200 g／m l），腫瘤體積顯著下降（P＜0.05）；此外，異種移植瘤的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生明顯變化，包括核固縮、染色質(zhì)凝聚等；IHC結(jié)果顯示nm23-H1表達(dá)增加，而MMP-9表達(dá)下降；WB針對以上兩種蛋白的結(jié)果也顯示出一致的趨勢，尤其在200 g／m l劑量組。此外，WB結(jié)果顯示CyclinD1，bcl-2的蛋白表達(dá)減少，而Bax和Caspase-3增加。認(rèn)為EAE能有效抑制腫瘤的生長和誘導(dǎo)凋亡，并抑制侵襲和轉(zhuǎn)移。Weng等［11］采用ICR小鼠建立HEPG2異種移植瘤模型，將富含透明質(zhì)酸的靈芝提取物（GLE）口服給藥后，腫瘤的平均大小、體積和重量均降低，且與劑量相關(guān)。出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性荷瘤小鼠數(shù)量、累積臟器數(shù)、病灶數(shù)，以及血清MMP-2和MMP-9的活性，同樣被顯著降低。認(rèn)為GLE可用于預(yù)防高侵襲性肝癌細(xì)胞腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

1.2.2 體外實(shí)驗(yàn)研究 Ju等［12］采用銀杏葉甲醇提取物（MMPL），呈劑量依賴性地抑制SK-Hep1和HuH7細(xì)胞的遷移和侵襲。MMPL對MMP-2和MMP-9活性有較強(qiáng)的抑制作用。此外，對端粒酶活性和端粒酶相關(guān)基因表達(dá)均有抑制作用。Fang等［13］在獼猴桃根提取物抗HCC活性和分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，用acRoots和前列腺素E受體3（EP3）拮抗劑L-798106治療可致HCC細(xì)胞中VEGF、EGFR、MMP-2和MMP-9表達(dá)降低，同時(shí)對細(xì)胞生長、遷移、侵襲和凋亡有顯著影響；且該效果可被EP3激動劑sulprostone逆轉(zhuǎn)／阻斷。提示acRoot通過抑制EP3表達(dá)抑制HCC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致VEGF、EGFR、MMP-2和MMP-9的活化減少。Byambaragchaa等［14］發(fā)現(xiàn)雪蓮乙醇提取物SIE能抑制人肝癌細(xì)胞SK-Hep1的侵襲和運(yùn)動，且這種效應(yīng)與MMP-2／MMP-9表達(dá)降低有關(guān)。Wang等［15］發(fā)現(xiàn)野菊花醇提物（CIE）顯著抑制MHCC97H的增殖和侵襲，其機(jī)制可能與降低MMP表達(dá)并增加TIMP-1表達(dá)有關(guān)。Park等［16］發(fā)現(xiàn)黃芩醇提物通過調(diào)控HepG2細(xì)胞MMP-2和FOXM1轉(zhuǎn)錄和翻譯活性從而抑制HepG2肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Lee等［17］研究觀察藥用植物赤松葉提取物RP及其酚類植物化學(xué)物表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EGC）和兒茶素沒食子酸酯（CG）對SKHep-1人肝癌細(xì)胞侵襲的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RP抑制SK-Hep-1細(xì)胞的侵襲和遷移，而其中有效成分EGCG和CG以劑量依賴方式降低MMP-2和MMP-9活性。認(rèn)為RP抑制腫瘤的侵襲和遷移，主要與EGCG和CG的作用有關(guān)。Dai等［18］從半枝蓮中獲取總黃酮類化合物TF-SB作用于MHCC97H人肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TF-SB能明顯抑制其增殖和侵襲，且呈劑量依賴性。在mRNA和蛋白水平上，經(jīng)TF-SB處理后，MMP-2和MMP-9的表達(dá)均明顯下降；Timp-1和Timp-2的表達(dá)同時(shí)增加。結(jié)果表明TFSB可能通過降低MMP的表達(dá)，同時(shí)增加TIMP的表達(dá)，降低MHCC97H細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。Park等［19］通過Boyden小室體外侵襲測試表明七灶花楸水提取物SC能抑制人肝癌Hep3B細(xì)胞的遷移和侵襲，明膠酶譜法顯示MMP-9的活性、基因和蛋白表達(dá)量均被降低。此外，趨化因子受體CXCR4和CXCR6基因表達(dá)被抑制；肌動蛋白纖維組織明顯抑制。Cha等［20］通過明膠酶譜法顯示鬼箭羽丁醇萃取物可抑制MMP-9活性且呈濃度依賴性。Chang等［21］觀察到紅曲提取物對人肝癌SK-Hep-1細(xì)胞具有明顯的抗侵襲和抗遷移活性，與誘導(dǎo)nm23-H1表達(dá)和下調(diào)MMP-2和MMP-9活性有關(guān)。

2 與EMT有關(guān)

2.1 復(fù)方體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 Zhang等［22］建立HCCLM3-G高轉(zhuǎn)移潛能原位異種裸鼠移植瘤模型，2周后進(jìn)行不充分射頻消融處理，24 h后設(shè)置對照組、IFN-α組、松友飲組和全量聯(lián)合組。其中，IFN-α治療為皮下注射0.1ml IFN-α，7.5×106U／（kg·d）；松友飲治療為灌胃口服0.1m l，8.4 g／（kg·d）。連續(xù)5周。結(jié)果顯示聯(lián)合治療顯著降低了殘余腫瘤的大小，最大限度地降低了肺轉(zhuǎn)移率，并延長了裸鼠的生存期。認(rèn)為IFN-α聯(lián)合松友飲治療，能削弱射頻消融處理后殘余腫瘤增強(qiáng)的轉(zhuǎn)移潛能，而該作用可能通過抑制β-catenin的激活介導(dǎo)的EMT抑制來實(shí)現(xiàn)。Zhong等［23］采用SMMC7721細(xì)胞建立脾臟注射肝轉(zhuǎn)移動物模型后，健脾化瘀湯水提物（JHD）由人參20 g、白術(shù)15 g、山藥12 g、茯苓15 g、牡丹皮10 g、丹參15 g、郁金10 g、莪術(shù)10 g、柴胡15 g、炙甘草6 g等組成）灌胃給藥5周。發(fā)現(xiàn)對照組（造模后給予生理鹽水）動物出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移比例為70%，給藥后下降至40%。取腫瘤組織制作HE染色結(jié)果顯示，對照組內(nèi)有著較為密集的血管分布；此外，針對EMT過程中一些分子的免疫組化結(jié)果顯示，JHD組內(nèi)E-cad和EpCAM較對照組要高，而N-cad和波形蛋白卻顯著低于對照。因此認(rèn)為JHD的治療能有效抑制EMT，從而阻止腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

2.2 復(fù)方體外實(shí)驗(yàn)研究 Zhong等［23］發(fā)現(xiàn)JHD可抑制SMMC7721肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與增加Smad7的mRNA和蛋白水平，降低pSmad3的蛋白水平以及增加E-cad表達(dá)水平，降低N-cad和波形蛋白的表達(dá)水平等有關(guān)。同時(shí)在該研究中發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA具有類似的功效，因此推測是JHD起效的主要的功能藥物單體。Zheng等［24］采用松友飲預(yù)處理MHCC97H 4周，建立MHCC97HSYY細(xì)胞系，同時(shí)采用未處理的MHCC97H細(xì)胞作為對照。WB和ELISA結(jié)果顯示松友飲能抑制EMT相關(guān)的變化和TGF-β1的表達(dá)；松友飲預(yù)處理能明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)變化和逆轉(zhuǎn)EMT標(biāo)志物E-cad和N-cad的表達(dá)；抑制TGF-β1的下游蛋SMAD2和SMAD3的磷酸化；抑制TGFβ1誘導(dǎo)的MHCC97細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

3 與經(jīng)典信號通路有關(guān)

3.1 TGF-β／SMAD信號通路

3.1.1 復(fù)方體外實(shí)驗(yàn)研究 Liang等［25］發(fā)現(xiàn)解毒方醇提物（JR，由獼猴桃根、鼠尾草、山慈菇、雞內(nèi)金組成），能抑制TGFβ1誘導(dǎo)HuH7和SMMC7721肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。采用JR預(yù)處理SMMC7721，能阻斷TGFβ1誘導(dǎo)的Smad2／3，Akt和MAPKs的激活，能抑制TGFβ1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。認(rèn)為該方能抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，通過EMT，通過Smad2／3依賴或非依賴通路而實(shí)現(xiàn)。Liu等［26］將來源于黃芪和丹參的混合物CASE，即黃芪苷、黃芪多糖和丹參酚酸粉末按70∶1∶1.85比例組成。將不同劑量CASE作用于HEPG2肝癌細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)：40μg／ml劑量時(shí)，TGF-β引起的細(xì)胞侵襲作用被明顯抑制，連接區(qū)Smad3的磷酸化（pSmad3L）和C端Samd2的磷酸化（pSmad2C）均被顯著降低；20μg／m l劑量下，C端磷酸化（pSmade3C）輕度增加；80μg／ml的CASE降低Smad2／3／4復(fù)合體水平，Smad7卻被上調(diào)且呈劑量依賴性。此外，纖溶酶原激活物抑制劑1型（PAI-1）轉(zhuǎn)錄活性也被抑制。以上表明CASE通過調(diào)節(jié)TGF-β／Smad信號來發(fā)揮其抗HepG2肝癌細(xì)胞侵襲的作用。

3.1.2 單味藥體外實(shí)驗(yàn)研究 Liu等［27］將瑞香狼毒提取物（ESC）作用于HepG2肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可以逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞離散；下調(diào)Vimentin和上調(diào)E-cad逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的EMT；抑制TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲；抑制TGF-β啟動的Smad信號通路。即ESC可以通過抑制Smad信號通路逆轉(zhuǎn)HepG2肝細(xì)胞中TGF-β介導(dǎo)的EMT。

3.2 MAPK、ERK信號通路

3.2.1 復(fù)方體外實(shí)驗(yàn)研究 Chen等［28］選取綜合清熱解毒（Q）、活血化瘀（H）、扶正固本（F）的復(fù)方QHF，由如下藥物按照一定比例構(gòu)成：華蟾素注射液∶人參皂苷3∶三七總皂苷∶香菇多糖＝57∶1∶0.4∶7。結(jié)果顯示，除了抑制細(xì)胞運(yùn)動外，QHF顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖并具有濃度依賴性，降低了腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移。此外，QHF作用24 h后，pERK顯著降低而pP38和pJNK的表達(dá)增加，但ERK、P38和JNK蛋白的總量保持不變。使用ERK抑制劑能改變P38和JNK的蛋白表達(dá)，促進(jìn)QHF的抗侵襲作用，而P38和JNK抑制劑只能部分逆轉(zhuǎn)這種作用。因此，該研究表明QHF能夠抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲活性，可能的機(jī)制涉及P38和JNK／MAPK信號通路的激活和ERK信號通路的減弱。

3.2.2 單味藥體外實(shí)驗(yàn)研究 Zhang等［29］觀察到地鱉蟲提取物（ESWE）通過下調(diào)PKC、AKT、MAPK等信號通路，以及PLG、NFκB和P53等蛋白來抑制SMMC-7721細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移。Yeh等［30］發(fā)現(xiàn)欖仁樹葉子提取物（TCE）具備抗HuH7細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用。TCE通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子SP-1和NF-κB DNA結(jié)合活性，有效抑制ERK1／2信號通路的磷酸化，從而導(dǎo)致u-PA抑制和抑制轉(zhuǎn)移。Weng等［11］研究發(fā)現(xiàn)靈芝提取物（GLE），能以劑量依賴性方式降低佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞MMP-9表達(dá)。該作用通過抑制ERK1／2和蛋白激酶B在胞質(zhì)中的磷酸化，以及降低細(xì)胞核中激活蛋白-1和核因子kappa B的水平而實(shí)現(xiàn)。Park等［19］發(fā)現(xiàn)七灶花楸水提取物（SC）在50和100μg／ml濃度下，可降低ERK和p38 MAPK的磷酸化水平，可略微提高JNK的磷酸化水平。另外，SC處理對κB抑制劑IκB的蛋白水平和NF-κB的p65亞單位沒有影響，提示ERK和p38信號通路可能參與了Hep3B細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)分子的表達(dá)。

3.3 β-catenin有關(guān)信號通路

3.3.1 單味藥體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 Wu等［31］建立HA22T移植裸鼠模型后，采用花椒提取物（YBBE）處理，發(fā)現(xiàn)PP2Acα、GSK-3β、APC和β-TrCP／HOS水平呈現(xiàn)強(qiáng)勁增長趨勢，而β-catenin、p-GSK-3β、TBX3和IL8等蛋白呈下降趨勢。此外，YBBE通過促進(jìn)β-catenin蛋白質(zhì)體降解，從而顯著下調(diào)胞核和胞質(zhì)中β-catenin水平。

3.3.2 單味藥體外實(shí)驗(yàn)研究 Tsai等［32］在研究大黃調(diào)控βcatenin和影響肝癌轉(zhuǎn)移作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)大黃提取物以劑量依賴的方式抑制HA22T肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。其機(jī)制與大黃抑制GSK-3-β蛋白水平以使Wnt信號傳導(dǎo)失活并降低β-catenin水平有關(guān)。Wu等［31］在研究花椒提取物YBBE抑制HA22T肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制時(shí)，通過免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)，YBBE可直接促進(jìn)GSK-3β、β-TRCP、APC、PP2A和β-catenin之間的蛋白相互作用。綜合分析以上發(fā)現(xiàn)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為在高轉(zhuǎn)移性HA22T細(xì)胞中，YBBE通過激活PP2A來抑制β-catenin參與的轉(zhuǎn)移信號通路。

3.4 其他信號通路 Jue等［33］在體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)單味藥南蛇藤提取物（COE）通過下調(diào)Notch1信號通路，抑制HCC細(xì)胞的增殖和侵襲并且具有濃度依賴性，且TGF-β1誘導(dǎo)的血管生成擬態(tài)可被其阻斷。Jang等［34］發(fā)現(xiàn)單味藥青蒿醇提物（ACE），具備抑制HEPG2和HUH7肝癌細(xì)胞的增殖、抑制HUH7細(xì)胞克隆形成、抑制HUH7細(xì)胞的遷移等多種抗腫瘤作用，并認(rèn)為以上作用與ACE對IL-6／STAT3通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。Lu等［35，36］在研究行氣活血單味中藥預(yù)知子抑制肝癌細(xì)胞增殖作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)預(yù)知子種子提取物（ATKSE）能使HepG2肝癌細(xì)胞G2／M期后的連續(xù)峰面積減少，而該連續(xù)峰的產(chǎn)生與面積與細(xì)胞之間的粘附程度相關(guān)；未處理HepG2細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，通過纖毛連接緊密；ATKSE作用后細(xì)胞的相互連接依然，但部分相互連接區(qū)域已經(jīng)出現(xiàn)分離；且基因芯片結(jié)果顯示大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因出現(xiàn)表達(dá)差異，提示該通路活躍。因此推測ATKSE可能也具備抑制肝癌細(xì)胞粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移作用。進(jìn)一步采用多種肝癌細(xì)胞系開展體外研究并發(fā)現(xiàn)可能與以下機(jī)制相關(guān)：抑制ITGA2、ITGB5和pFAK等Integrin介導(dǎo)的細(xì)胞粘附通路上游蛋白的表達(dá)，使下游pERK1／2、pJNK等部分失活，進(jìn)而間接或直接抑制MMP-2等蛋白的表達(dá)，即通過抑制HepG2肝癌細(xì)胞的增殖、粘附、遷移和侵襲等環(huán)節(jié)，最終抑制其遷移侵襲。

4 與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)

4.1 復(fù)方體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 Zhang等［37］采用C57小鼠皮下注射Hepa1-6鼠源性肝癌細(xì)胞系和尾靜脈注射Hepa1-6-GFP的方式建立皮下腫瘤和實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型，采用松友飲進(jìn)行單獨(dú)或聯(lián)合適當(dāng)游泳（每日游泳8min）進(jìn)行治療。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療能顯著抑制腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移，并延長荷瘤小鼠生存期，顯著提高外周血CD4與CD8的比例，降低血清TGF-β1水平，降低Treg細(xì)胞在外周血、脾臟和腫瘤組織中的比例。聯(lián)合治療在抑制肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移方面有增效作用，明顯優(yōu)于單用松友飲或單獨(dú)游泳組。

4.2 單味藥體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 Sunwoo等［38］采用SD大鼠每周一次腹膜內(nèi)注射二乙基亞硝胺（DEN）50 mg／kg，持續(xù)16周建立肝癌模型后，隨機(jī)將其分為對照組，白花蛇舌草水提物（OD）100 mg／kg和200 mg／kg灌胃治療組。治療28d后，進(jìn)行PET／CT成像和數(shù)據(jù)分析、肝功能檢測、肉眼觀察肝臟來計(jì)數(shù)腫瘤、肝組織抗增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）IHC以及存活率等指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，OD處理組（100和200 mg／kg）中的血清ALP、AST和ALT水平顯著降低（P＜0.05）。此外，OD治療組（100和200 mg／kg）的結(jié)節(jié)大小分布和肝／體比顯著降低（P＜0.05）。認(rèn)為OD可通過增強(qiáng)肝功能來抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的能力。Zhou等［39］采用C57小鼠建立移植H22肝癌模型和B16黑色素瘤模型，灌胃給予低〔40 g／（kg·d）〕、中〔200 g／（kg·d）〕、高〔1 000 g／（kg·d）〕不同劑量的桑黃提取物PI后，檢查T淋巴細(xì)胞，抗體，細(xì)胞因子，LAK、NK細(xì)胞在脾臟的活性、腫瘤細(xì)胞凋亡狀態(tài)及腫瘤組織中iNOS、PCNA的表達(dá)。其中，部分動物在腫瘤細(xì)胞接種24 h后即開始灌胃給藥36d；部分動物則是預(yù)防性的給藥7d時(shí)再接種腫瘤細(xì)胞，即共計(jì)給藥42d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI提取液能提高動物的免疫力，起到抑制癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移作用，并存在量效關(guān)系。

5 與腫瘤血管生成和微環(huán)境有關(guān)

5.1 復(fù)方體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 Min L等［40］觀察補(bǔ)陽還五湯水提物（BYHWD，由黃芪120 g、當(dāng)歸6 g、赤芍5 g、地龍3 g、獨(dú)活3 g、桃仁3 g、紅花3 g組成）對HCCLM3異種移植荷瘤裸鼠腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和血管生成的影響。給藥設(shè)置全方組（LB）以及益氣（YQD）和活血（HXD）兩個(gè)拆方組。其中YQD包含120 g黃芪，HXD則由剩下藥物組成。各組又隨機(jī)分為3個(gè)亞組：分別灌胃治療21d、28d和35d。全方、益氣、活血水提物分別被濃縮至含生藥1.03、0.56和0.166 g／ml，每只動物灌胃同樣體積藥物0.2 m l。檢測指標(biāo)包括腫瘤重量、體積和肺轉(zhuǎn)移；CD105的表達(dá)和微血管密度（MVD），以及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）以及G蛋白信號調(diào)控因子5（RGS 5）。結(jié)果顯示，與模型組比較，中藥治療后腫瘤重量或體積沒有明顯下降；肺部轉(zhuǎn)移數(shù)量減少；全方治療35d組RGS-5和HIF-1α表達(dá)水平下降。但是，在治療后第28天和第35天，全方組中VEGF的表達(dá)水平增加。研究結(jié)果表明，BYHWD可能通過影響VEGF、RGS-5和HIF-1α的表達(dá)水平來抑制腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移，可能有助于HCC的腫瘤微環(huán)境和血管正常化。

5.2 單味藥體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 Wang等［41］采用能表達(dá)紅色熒光蛋白（RFP）的HepG2建立裸鼠肝臟原位移植模型。一組動物在腫瘤細(xì)胞植入術(shù)后第3天進(jìn)行早期治療，即采用南蛇藤乙酸乙酯提取物（COT）口服給藥（20 mg／kg）；所有其他動物，從植入腫瘤細(xì)胞后第20天起，隨機(jī)分成4組，分別接受不治療、奧沙利鉑（25 mg／kg），COT低劑量（20 mg／kg）和COT高劑量（40 mg／kg）處理。研究期間采用熒光全身成像技術(shù)定位表達(dá)轉(zhuǎn)移的RFP，以實(shí)時(shí)監(jiān)測腫瘤生長和轉(zhuǎn)移；取腫瘤組織進(jìn)行VEGF免疫組化染色，以及PCR檢測VEGF轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示COT高劑量和早期治療對控制腫瘤體積和腫瘤重量有顯著療效；奧沙利鉑和COT治療均能顯著降低腫瘤VEGF表達(dá)；對淋巴結(jié)、脾臟、肺、肝、膈、腹腔和胸腔等局部和遠(yuǎn)處器官的潛在轉(zhuǎn)移進(jìn)行了仔細(xì)的觀測，發(fā)現(xiàn)任何治療組和對照組的轉(zhuǎn)移發(fā)生率均無顯著差異。

6 其他

6.1 復(fù)方體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 Yin等［42］采用Bel-7402肝癌細(xì)胞建立BALB／C無胸腺小鼠模型，設(shè)置西藥對照組（非腸胃給藥FT207，替加氟，8 mg／m l，0.2 m l／10 g體重）以及由莪術(shù)15g、半枝蓮30g等組成的扶正解毒湯（FJD）。FJD分為低（粗提物0.25 g／ml，0.2 ml／10 g體重）、中（0.5 g／ml，0.2 ml／10 g體重）、高（1.0 g／ml，0.2 ml／10 g體重）三種劑量組。觀察生存期、腫瘤體積、腫瘤指數(shù)和肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移情況；通過免疫組化檢測肝組織、癌旁組織和癌組織中的PTEN水平及變化。治療4周后，治療組（3個(gè)中藥組相加）總生存率50%，F(xiàn)T207治療組生存率0；除中藥低劑量組外，其余組與對西藥對組間在腫瘤體積、腫瘤指數(shù)上并無顯著差異（P＞0.05）；治療組肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移少于對照組；IHC結(jié)果顯示，癌旁組織中PTEN的強(qiáng)度最高，然后是肝組織，癌組織最低；在各種組織中，中藥治療組PTEN的強(qiáng)度均明顯高于西藥對照組；中藥治療組中又以中劑量組為最高，低劑量組和高劑量組間并無差異。結(jié)果表明FJD可以延長生存期、減少腫瘤肝轉(zhuǎn)移；認(rèn)為FJD用于治療HCC的機(jī)制可能部分與增強(qiáng)肝臟組織中PTEN的表達(dá)有關(guān)。

6.2 復(fù)方體外實(shí)驗(yàn)研究 Hu等［43］采用水煎醇提的方式獲得養(yǎng)肝解毒散結(jié)方（由女貞子12g、舌莓15g、龍葵15g、半枝蓮30g、澤漆15g、貓爪草15g、郁金15g、黃芪15g組成）提取物（YGJDSJ）。發(fā)現(xiàn)YGJDSJ能抑制Bel-7402細(xì)胞的懸浮生長、增加ROS的生成，激活Caspase-3、-8和-9，下調(diào)調(diào)節(jié)PTK2，從而誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞失巢凋亡。該研究雖未提供YGJDSJ影響肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移方面的直接數(shù)據(jù)，但認(rèn)為由于失巢凋亡與腫瘤轉(zhuǎn)移和血液或淋巴循環(huán)中的細(xì)胞存活有關(guān)，推測YGJDSJ可能影響肝癌轉(zhuǎn)移，或影響血液或淋巴循環(huán)中的肝癌細(xì)胞。

6.3 單味藥體外實(shí)驗(yàn)研究 Hsieh等［44］在穿龍薯蕷提取物（DNE）抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的研究中發(fā)現(xiàn)，DNE能顯著抑制HuH7肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。DNE抑制MMP-9和u-PA的活性和蛋白水平以及PI3K和Akt的磷酸化；mRNA水平和啟動子的測試均顯示DNE對u-PA表達(dá)的抑制作用；染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）檢測不僅顯示DNE抑制u-PA表達(dá)，而且抑制作用與NF-κB和SP-1信號通路轉(zhuǎn)錄因子的下調(diào)有關(guān)。這些結(jié)果表明u-PA表達(dá)可能是DNE介導(dǎo)的HCC侵襲／遷移抑制中的有效治療靶標(biāo)。Kabir等［45］將中草藥三椏苦己烷提取物（MP-hx）同時(shí)作用于HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞，獲取RNA后進(jìn)行基因芯片檢測，發(fā)現(xiàn)分別有1 290和1 325個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá)。其中MP-hx上調(diào)的一些基因包括轉(zhuǎn)移抑制基因NDRG1。Ceccarini等［46］將意大利產(chǎn)枸杞子提取物（生理溶液中勻漿離心后取上清）作用于HEPG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)參與氧化應(yīng)激、增殖、凋亡的眾多基因表達(dá)，如下調(diào)CCL5、DUSP1等基因，CCL5與腫瘤遷移和侵襲有關(guān)，而DUSP1意味著增高的轉(zhuǎn)移和抗凋亡風(fēng)險(xiǎn)。Kim等［47］發(fā)現(xiàn)蒺藜水提物可抑制與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、抗凋亡和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)。

7 結(jié)語

通過對文獻(xiàn)中涉及到的復(fù)方和單味藥內(nèi)容進(jìn)行整理，發(fā)現(xiàn)復(fù)方涉及松友飲、健脾化瘀湯、補(bǔ)陽還五湯、扶正解毒湯、復(fù)方抑瘤飲等，其中，又以松友飲研究較多。單味中藥提取物中，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)涉及白花蛇舌草、澤漆、桑黃、靈芝、半枝蓮、南蛇藤、花椒等；體外實(shí)驗(yàn)則涉及銀杏葉、獼猴桃根、雪蓮、野菊花、黃芩、赤松葉、南蛇藤、七灶花楸、鬼箭羽、地鱉蟲、瑞香狼毒、欖仁樹葉、大黃、青蒿、預(yù)知子、穿龍薯蕷、三椏苦、枸杞子、紅曲、蒺藜等多種單味藥。

從文獻(xiàn)中涉及到復(fù)方和單味藥數(shù)量，以及體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)等亞分類方面進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)關(guān)于復(fù)方的文獻(xiàn)數(shù)量較單味藥少；同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)居多，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)偏少，推測與復(fù)方有效成分的鑒定復(fù)雜、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究影響因素更多相關(guān)。隨著技術(shù)手段的更新，今后關(guān)于復(fù)方的研究可能會逐漸增多。此外，由于目前肝癌臨床中醫(yī)藥辨證論治方面，仍然以復(fù)方用藥為主，故本次未將中藥單體納入，只關(guān)注中藥復(fù)方和單味藥；而復(fù)方和單味藥的提取物如水提物或醇提物，其中往往含有多種成分，與靶向相對明確的單體不同。但是，明確復(fù)方、單味藥有效成分，以及在此基礎(chǔ)上的有效成分之間的配伍組合，甚至和療效明確的肝癌分子靶向藥物的組合運(yùn)用，可能是今后重要研究方向。

從復(fù)方或單位中藥提取物的給藥方式來看，以動物為對象的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)多以灌胃給藥為主。鑒于體外實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞給藥方式，實(shí)質(zhì)上更接近于整體實(shí)驗(yàn)下的局部給藥效應(yīng)，與消化道給藥有著很大不同。因此，在復(fù)方或單味藥體外實(shí)驗(yàn)充分、有效篩選的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步拓展至動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，如何嘗試局部給藥？值得思考。

以上文獻(xiàn)，有些研究主要關(guān)注侵襲轉(zhuǎn)移本身，有些會同時(shí)關(guān)注增殖與侵襲轉(zhuǎn)移，往往表現(xiàn)出單味藥或復(fù)方提取物對細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移均產(chǎn)生影響。雖然從技術(shù)角度而言，可以最大限度地排除增殖對細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，但是，細(xì)胞本身的增殖狀態(tài)，是其生物學(xué)行為如侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。所以，在關(guān)注這些文獻(xiàn)結(jié)論時(shí)，應(yīng)該充分意識到這一點(diǎn)，不能把二者輕易割裂開來。

在復(fù)方或單味藥的作用機(jī)制方面，文中雖然嘗試進(jìn)行分類，但是，鑒于復(fù)方或單味藥提取物與靶向明確的單一成分不同，作用于細(xì)胞后，往往會引起一系列的分子事件，如影響多種通路，或者既影響MMPs，同時(shí)也可能影響EMT。因此作用機(jī)制會出現(xiàn)交叉，文中已有多次反映。整體而言，雖然中醫(yī)藥復(fù)方或單味藥抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用肯定且具研究價(jià)值，但是在具體機(jī)制的認(rèn)識上仍然存在許多不一致，值得后續(xù)深入研究。