孫雨陽， 羅 均， 劉 娜， 楊 揚(yáng)， 孫 翊

(上海大學(xué)機(jī)電工程與自動(dòng)化學(xué)院， 上海200444)

蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)環(huán)境中可能因受到多種復(fù)雜的化學(xué)降解和物理反應(yīng)而失活， 如凝聚、沉淀、水解等. 同時(shí)， 蛋白質(zhì)藥物具有半衰期短， 清除率高， 分子量大， 透膜能力差， 易受到體內(nèi)酶、細(xì)菌以及體液破壞的特點(diǎn)[1]. 水凝膠具備優(yōu)良的生物相容性和生物組織相似性， 在藥物儲(chǔ)存、運(yùn)輸方面有著廣泛應(yīng)用[2]. 如含水量較高的水凝膠可以為有機(jī)小分子提供含水環(huán)境， 保留蛋白質(zhì)藥物的生物活性， 使得水凝膠封裝的蛋白質(zhì)比分散在溶液中的自由蛋白質(zhì)更具耐變性[3]. 將蛋白質(zhì)藥物包封在水凝膠中， 可以對(duì)蛋白質(zhì)起到一定的保護(hù)作用[4]， 并可用于蛋白質(zhì)藥物的可控釋放.

聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate， PEGDA)水凝膠具有較好的化學(xué)、機(jī)械和生物特性， 可有效屏蔽封裝藥物的生物免疫原性， 增強(qiáng)其對(duì)外界條件(酸、堿、酶、水和熱等)的耐受能力， 延長生物藥物在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期， 是用于藥物可控釋放和組織工程研究的理想載體材料之一[5]. 實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)封裝并形成特定水凝膠微結(jié)構(gòu)的加工方法對(duì)上述應(yīng)用有直接影響， 具有重要研究價(jià)值[6]. 目前， 用于PEGDA 水凝膠微結(jié)構(gòu)的加工方法， 如激光掃描光刻法[7-9]、投影印刷技術(shù)[10-12]等， 主要是基于紫外光誘發(fā)光敏引發(fā)劑的聚合原理. 在這些方法中， 水凝膠的形狀主要通過設(shè)計(jì)光學(xué)掩膜板或設(shè)置紫外激光掃描路徑來控制[13]. 然而， 紫外線照射和光引發(fā)劑具有生物毒性， 容易引發(fā)蛋白質(zhì)的改性， 并且基于紫外固化的加工難以實(shí)現(xiàn)管狀和高深寬比等復(fù)雜微結(jié)構(gòu)的加工[14]. 電化學(xué)聚合原理也可用于PEGDA 水凝膠的固化成形， 但是傳統(tǒng)電聚合方法加工的水凝膠結(jié)構(gòu)厚度有限(幾百納米)， 且不能靈活控制水凝膠的幾何形狀[15].

針對(duì)蛋白質(zhì)封裝復(fù)合水凝膠的應(yīng)用需求， 以及當(dāng)前PEGDA 水凝膠加工方法的不足， 本工作研究了一種基于光誘導(dǎo)電聚合原理的水凝膠圖形化加工方法， 并以免疫球蛋白(immunoglobulin G，IgG)為例，通過實(shí)驗(yàn)分別實(shí)現(xiàn)了PEGDA 水凝膠微結(jié)構(gòu)和IgG/PEGDA復(fù)合水凝膠微結(jié)構(gòu)的圖形化加工. 本方法不需要采用定制的光刻掩膜板、紫外光和光敏引發(fā)劑， 而是利用電腦設(shè)計(jì)的光斑圖形通過聚光鏡投射到光誘導(dǎo)芯片上實(shí)現(xiàn)圖形化加工. 在加工過程中， 投射到光誘導(dǎo)芯片上的光圖形通過光電轉(zhuǎn)換原理在光誘導(dǎo)芯片上產(chǎn)生圖形化的虛擬電極. 該虛擬電極在交流電壓的作用下可誘導(dǎo)PEGDA分子在其表面發(fā)生聚合反應(yīng)并封裝蛋白質(zhì)分子形成復(fù)合凝膠微結(jié)構(gòu). 由于聚合反應(yīng)只在虛擬電極表面發(fā)生， 因此水凝膠微結(jié)構(gòu)的形狀與光斑圖形一致， 通過改變光斑圖形來改變虛擬電極的形狀即可改變凝膠微結(jié)構(gòu)的形狀. 此外，在凝膠微結(jié)構(gòu)加工過程中， 凝膠微結(jié)構(gòu)的高度隨著聚合時(shí)間的增加而增加， 可以通過控制聚合時(shí)間來實(shí)現(xiàn)對(duì)凝膠微結(jié)構(gòu)高度的控制. 因此， 通過調(diào)控光斑圖形和聚合時(shí)間， 即可實(shí)現(xiàn)多種幾何形狀的水凝膠微結(jié)構(gòu)加工.

1 實(shí)驗(yàn)方法和材料

1.1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

圖1 為用于水凝膠微結(jié)構(gòu)加工的光誘導(dǎo)電聚合實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)， 主要有3 個(gè)組成部分， 包括圖像投影模塊、觀測控制模塊和光誘導(dǎo)電聚合(optically-induced electropolymerization， OEP)芯片[16]. 圖像投影模塊的投影儀與裝有繪圖軟件(如微軟PowerPoint 或Adobe Flash)的計(jì)算機(jī)(電腦2)相連， 用于設(shè)計(jì)和輸出光斑圖形. 投影儀投出的光圖形通過聚光透鏡被投影到OEP芯片上(見圖1 中的插圖). OEP 芯片固定在三維移動(dòng)平臺(tái)上， 主要包括上層氧化銦錫(indium tin oxide， ITO)玻璃電極、微流體小腔室、下層氫化非晶硅玻璃電極. 氫化非晶硅玻璃電極是利用等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積(plasma enhanced chemical vapor deposition， PECVD)法將a-Si:H 層加工到ITO 玻璃電極上得到的[17]. 微流體小腔室是利用厚度為50 μm 的雙面膠粘合上層ITO 玻璃和下層氫化非晶硅玻璃制成的， 用于容納PEGDA 分子和蛋白質(zhì)的混合溶液.觀測控制模塊由電腦1、顯微鏡和三維移動(dòng)平臺(tái)構(gòu)成， 用于控制微結(jié)構(gòu)加工位置和實(shí)時(shí)監(jiān)測、記錄水凝膠的成形過程.

圖1 光誘導(dǎo)電聚合實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)Fig.1 Experimental system for OEP

1.2 溶液配制

用于制作純PEGDA 微結(jié)構(gòu)的溶液配制過程如下: 將PEGDA 原溶液(分子量為575 或10 kD)與去離子水以 1∶4 混合， 攪拌約 10 min， 直到 PEGDA 充分溶解. 制備的 PEGDA 溶液的分子濃度約為340 mol/m3， 電導(dǎo)率約為1.5×10-3S/m. 用于制備包裹蛋白質(zhì)的PEGDA 水凝膠微結(jié)構(gòu)的溶液制備過程如下: 在1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的PEGDA 溶液中添加10 μL 濃度為0.1 g/mL的IgG， 并利用移液槍充分吹勻.

1.3 PEGDA 分子聚合過程

當(dāng)有光斑圖形投射到OEP 芯片上時(shí)， 光圖形照射區(qū)域的a-S:H 會(huì)產(chǎn)生電子躍遷形成電子空穴對(duì)， 大大增加圖形區(qū)域的電導(dǎo)率. 在本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中， 將 RGB 值為(0， 255， 0)的綠色光圖形通過投影儀投射到氫化非晶硅薄膜上， 使其電導(dǎo)率從10-11S/m 升至10-5～10-4S/m， 形成“虛擬”電極.

當(dāng)制備水凝膠微結(jié)構(gòu)時(shí)， 信號(hào)發(fā)生器輸出的交變電壓被加載到頂層和底層的ITO 基板之間， 用于激發(fā)水凝膠的電聚合過程. 水凝膠的電聚合主要受電極電位的控制， 當(dāng)電極/溶液界面上的電勢足夠大時(shí)， 可以激活聚合反應(yīng)的發(fā)生. 當(dāng)有光圖像投射到a-Si:H 芯片上形成虛擬電極時(shí)， 虛擬電極處的電極電位遠(yuǎn)大于無光照a-Si:H 區(qū)域的電極電位. 通過控制交流電壓的頻率和幅值， 可以使PEGDA 分子只在虛擬電極表面進(jìn)行交聯(lián)， 形成與投影圖像形狀相同的水凝膠結(jié)構(gòu). 圖2 是基于COMSOL 仿真軟件分析的電壓分布， 仿真采用的交流信號(hào)為幅值20 VPP， 頻率1 kHz 的正弦電壓. 可見， 光斑圖形照射的a-Si:H 區(qū)域的電極電勢遠(yuǎn)大于無光照區(qū)域的電極電勢.

圖2 OEP 芯片電勢分布的COMSOL 仿真分析結(jié)果Fig.2 Voltage distribution in OEP chip simulated by COMSOL

基于光誘導(dǎo)電聚合的PEGDA 水凝膠固化過程可以由圖3 描述[18]. 首先， 溶液中的水合氫離子H3O+運(yùn)動(dòng)到氫化非晶硅與溶液的界面層(Step a1)， H3O+分子在界面電場的作用下去水化形成H+(Step a2)并進(jìn)一步向界面雙電層移動(dòng)， 在界面電勢的作用下， H+得到電子被還原成活化氫原子(Step a3). 另一方面， 由于擴(kuò)散作用， 在固液界面層也會(huì)存在大量的PEGDA 分子， 而活化的氫原子可以打開PEGDA 分子中的碳碳雙鍵(C=C)， 進(jìn)而激發(fā)PEGDA 分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)(Step b2， 見圖3(b))， 交聯(lián)固化后的PEGDA 結(jié)構(gòu)可以從基底脫附(Step b3)， 使新的聚合反應(yīng)繼續(xù)發(fā)生， 形成新的PEGDA 結(jié)構(gòu)， 這樣一層一層的聚合使得PEGDA 的三維結(jié)構(gòu)制造得以實(shí)現(xiàn). 當(dāng)電極電勢過大或PEGDA 分子濃度過低， 使得產(chǎn)生的活化氫原子來不及被PEGDA 分子消耗時(shí)， 多余的氫原子會(huì)復(fù)合產(chǎn)生氫氣分子. 此時(shí)， 在PEGDA 三維結(jié)構(gòu)制造過程中會(huì)有氣泡產(chǎn)生， 由于產(chǎn)生的氣泡會(huì)在一定程度破壞PEGDA 結(jié)構(gòu)， 因此應(yīng)該盡量避免[18].

圖3 PEGDA 分子的光誘導(dǎo)電聚合反應(yīng)過程Fig.3 OEP process of PEGDA molecules

2 實(shí)驗(yàn)與討論

2.1 PEGDA 水凝膠微管的制作

為了驗(yàn)證本方法的可行性， 首先實(shí)驗(yàn)加工了微圓柱的實(shí)心水凝膠微結(jié)構(gòu). 利用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)4×3， 直徑為 13.5 μm 的圓形陣列圖像， 如圖 4(a)所示. 將圖形投影到 OEP 芯片上， 施加電壓峰峰值為20 V， 頻率為3～5 kHz 的正弦交流電壓. 如圖4(b)～(f)所示， 在圓形光斑所照區(qū)域，PEGDA 分子交聯(lián)固化形成水凝膠微結(jié)構(gòu); 隨著交聯(lián)時(shí)間的增加， 水凝膠微柱的長度明顯增加.但是， 由于重力的作用以及水凝膠微結(jié)構(gòu)自身剛度原因， PEGDA 水凝膠微管不能筆直伸展.

圖4 水凝膠微柱陣列的加工過程Fig.4 Manufacturing process of micro-pillar hydrogels arrays

2.2 IgG/PEGDA 復(fù)合水凝膠結(jié)構(gòu)

將IgG/PEGDA 混合溶液通入芯片， 用于加工復(fù)合水凝膠微結(jié)構(gòu). 為了驗(yàn)證光誘導(dǎo)電聚合方法能夠加工傳統(tǒng)加工方法難以加工的圓柱結(jié)構(gòu)， 本實(shí)驗(yàn)利用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)了一組4×4， 外徑為 54 μm， 內(nèi)徑為 27 μm 的圓環(huán)陣列， 用于復(fù)合水凝膠微結(jié)構(gòu)加工， 如圖 5(a)所示. 加工過程同樣采用電壓峰峰值為20 V， 頻率為3～5 kHz 的正弦交流電壓， 并用觀測控制模塊對(duì)水凝膠微結(jié)構(gòu)加工過程進(jìn)行監(jiān)測和記錄. 圖5(b)～(f)分別為交聯(lián)聚合發(fā)生10， 30， 50， 70 及90 s 后的水凝膠結(jié)構(gòu)， 可以觀察到隨著交聯(lián)時(shí)間的增加， 微結(jié)構(gòu)的高度也在增加， 并且可以觀察到水凝膠的結(jié)構(gòu)確實(shí)與投射光圖像的形狀一致， 為空心圓管結(jié)構(gòu).

為了證明IgG 確實(shí)被封裝在PEGDA 水凝膠中， 構(gòu)成了IgG/PEGDA 復(fù)合水凝膠， 在水凝膠微結(jié)構(gòu)制作完成后， 先后用酒精與去離子水清洗制作的微結(jié)構(gòu)， 并放置在熒光顯微鏡下觀察. 如圖6 所示， 水凝膠微管發(fā)出綠色熒光， 表明IgG 確實(shí)被封裝在PEGDA 水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中， 形成復(fù)合水凝膠. 圖6 內(nèi)部小圖為復(fù)合水凝膠微管的掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope， SEM)圖， 可見粗糙的管狀結(jié)構(gòu).

圖5 水凝膠微管陣列的加工過程Fig.5 Manufacturing process of micro-tubular hydrogels arrays

圖6 IgG/PEGDA 復(fù)合水凝膠微管結(jié)構(gòu)的熒光圖及SEM 圖Fig.6 Fluorescence and SEM image of IgG/PEGDA hydrogel microtubules

為了測試OEP 方法加工復(fù)合水凝膠微結(jié)構(gòu)的最小尺寸， 實(shí)驗(yàn)繪制了3 種不同直徑(16.2，13.5， 5.4 μm)的圓形圖像， 分別用于加工復(fù)合水凝膠微結(jié)構(gòu). 實(shí)驗(yàn)采用同一芯片， 聚合時(shí)間均為1 min. 實(shí)驗(yàn)加工的凝膠微結(jié)構(gòu)用酒精和去離子水進(jìn)行清洗后， 放置在熒光顯微鏡下觀察.圖7(a)～(c)分別為3 種水凝膠微結(jié)構(gòu)的光學(xué)圖像， 由于去離子水的沖洗作用使得加工的凝膠微結(jié)構(gòu)失去了原有的陣列排布. 圖7(d)～(f)分別為3 種水凝膠微結(jié)構(gòu)的熒光圖， 結(jié)果顯示IgG分子被充分地封裝在了交聯(lián)的水凝膠微結(jié)構(gòu)中. 圖7(g)～(i)為3 種水凝膠微結(jié)構(gòu)的SEM 圖，3 種結(jié)構(gòu)的直徑分別為 14～16， 11～12， 3～4 μm， 可見加工圖形的直徑略小于施加的光斑圖形的直徑. 比較圖7(g)～(i)可以看出， 利用不同尺寸的光斑圖像， 在相同的聚合時(shí)間內(nèi)凝膠微結(jié)構(gòu)的高度不同， 其中光斑直徑較小時(shí)凝膠微結(jié)構(gòu)的長度更長. 這是因?yàn)楫?dāng)光斑直徑較小時(shí)， 單位時(shí)間參與交聯(lián)固化的PEGDA 分子較少， 短時(shí)間從溶液擴(kuò)散到電極表面的PEGDA 分子就足以滿足聚合反應(yīng)， 凝膠結(jié)構(gòu)生長速度較快; 而隨著光斑直徑的增加， 單位時(shí)間參與交聯(lián)固化的PEGDA 分子增多， 所需要的PEGDA 分子擴(kuò)散時(shí)間也會(huì)增加， 凝膠結(jié)構(gòu)的生長速度變慢.總體而言， 凝膠微結(jié)構(gòu)的高度隨著交聯(lián)時(shí)間的增加而增加， 但其增加速度受到電極表面電勢和PEGDA 分子濃度的影響. 由于聚光鏡和投影儀配置的局限， 本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可設(shè)計(jì)的最小有效光斑尺寸為5.4 μm， 所以加工凝膠微結(jié)構(gòu)的最小尺寸為3～4 μm.

圖7 3 種不同尺寸凝膠微結(jié)構(gòu)的光學(xué)圖像、熒光圖像和SEM 圖Fig.7 Optical images， fluorescence images and SEM images of 3 different sizes of hydrogel microstructures

3 結(jié)束語

本工作提出了一種基于光誘導(dǎo)電聚合原理的IgG/PEGDA 復(fù)合水凝膠加工方法. 利用COMSOL 仿真軟件對(duì)光誘導(dǎo)電聚合過程的電壓分布進(jìn)行了仿真研究. 同時(shí)， 通過實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了IgG/PEGDA 復(fù)合水凝膠的微管和微柱結(jié)構(gòu)加工. 與傳統(tǒng)的PEGDA 水凝膠加工方法相比， 本方法不需要紫外光、光引發(fā)劑以及物理光刻掩膜， 而是直接利用光誘導(dǎo)電聚合原理， 通過控制光斑圖形和聚合時(shí)間實(shí)現(xiàn)多種形狀的水凝膠微結(jié)構(gòu)加工. 盡管只實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了封裝IgG 的復(fù)合水凝膠加工過程， 但本方法同樣適用于其他可電聚合的水凝膠分子和蛋白質(zhì)封裝.