張學峰,楊光旭,朱友,張丹丹,夏金榮,李衛(wèi)東

(1．東南大學附屬中大醫(yī)院江北院區(qū) 消化科，江蘇 南京 210048；2.東南大學附屬中大醫(yī)院 消化科，江蘇 南京 210009)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種與胰島素抵抗(insulin resistance, IR)和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷[1],已成為全球第一大肝病[2]。NAFLD與2型糖尿病有因果聯(lián)系，其聯(lián)系的共同環(huán)節(jié)是IR[3- 5]。而IR的實質(zhì)是肝臟、肌肉和脂肪等外周組織對胰島素敏感性減弱，表現(xiàn)為高血糖和高胰島素血癥[6]。肝臟作為物質(zhì)、能量和激素代謝的樞紐，發(fā)生NAFLD后肝臟的代謝能力可能會有變化。本研究通過動物實驗探索NAFLD對大鼠葡萄糖、胰島素代謝和肝糖原合成的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠24只(購于上海凱學生物科技有限公司)，8～12周齡，體重230～260 g，在溫度控制于(22±1)℃的動物飼養(yǎng)中心喂養(yǎng)。

1.2 試劑

胰島素ELISA試劑盒購自美國EMD Millipore公司,血糖檢測試劑盒購自美國Abbott Pharmaceutical公司，糖原檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司，抗-AKT抗體購自美國Cell Signaling Technology公司,抗p-AKT抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，抗-GSK3β抗體購自美國Boster Biological Technology公司，抗-p-GSK3B抗體購自美國Cell Signaling Technology公司,抗-actin抗體購自英國Abcam公司，二抗購自美國Novus Biologicals公司。PCR引物G6Pase-F 5′-AAGCCAACGTATGGATTCCG-3、G6Pase-R 5′-ACAGCAATGCCTGACAAGACT-3′,PEPCK-F 5′-GTGCTGGAGTGGATGTTCGG-3、PEPCK-R 5′-CTGGCTGATTCTCTGTTTCAGG-3′,PGC-1α-F 5′-CAATGAATGCAGCGGTCTTA-3′、PGC-1α-R 5′-GTGTGAGGAGGGTCATCGTT-3′和逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國New England BioLabs公司。

1.3 NAFLD大鼠模型的建立

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為模型組即高脂(hige fant diet，HFD)組和對照(control diet，CD)組，各12只。HFD組用88%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+2%膽固醇喂養(yǎng)，CD組只用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，均自由飲水、進食。持續(xù)喂養(yǎng)30 d，分別在第5、10、15、20、25、30天每組隨機選10只大鼠尾靜脈取血，檢測隨機血糖水平；第30天加測胰島素水平，且每組選擇2只大鼠斷頸處死，取部分肝臟切片行油紅O染色和HE染色；其余肝組織置-80 ℃液氮中保存。

1.4 HE和油紅O染色

4%多聚甲醛灌注固定，取固定好的肝臟組織進行常規(guī)HE染色。油紅O染色需先配制油紅O飽和液，即0.5 g油紅O充分溶于100 ml異丙醇中，按飽和液與水3∶2的比例配制成染液。取肝臟組織行厚度為8 cm 的冷凍切片，染色20 min，蘇木素復(fù)染核25 s，1%鹽酸分化后用流水沖洗反藍，甘油明膠封片后鏡下拍照觀察。

1.5 肝靜脈血葡萄糖、胰島素、肝臟糖原檢測

持續(xù)喂養(yǎng)30 d后，HFD組和CD組各取10只大鼠，禁食12 h后恢復(fù)大鼠飲食，分別在0、30、60、120、180 min 5個時點每組斷頸處死2只大鼠，切開腹壁，肝靜脈穿刺取血檢測血糖濃度和胰島素水平，并取部分肝臟組織檢測肝臟糖原含量，檢測步驟嚴格按試劑盒說明書操作。

1.6 糖原合成相關(guān)蛋白磷酸化水平檢測

取液氮保存的HFD組和CD組大鼠肝組織，冰上稱取100 mg肝組織剪碎放入研缽中，充分研磨組織，冰上裂解20 min，旋渦混合儀上電動30 s，重復(fù)4次，然后移1.5 ml至離心管中，4 ℃ 12 000 r·min-1離心30 min后收集上清液。采用SDS-PAGE凝膠電泳法測定，每道加50 μg蛋白，用積層膠和分離膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，30 mA通電3 h，含3%牛血清白蛋白的TBST室溫封閉2 h。用一抗4 ℃孵育過夜，相應(yīng)的二抗室溫孵育1.5 h，然后用TBS洗3次，每次10 min，采用化學發(fā)光法檢測肝組織中蛋白激酶B(AKT)和糖原合酶激酶3β(GSK3B)的蛋白磷酸化水平。

1.7 糖異生相關(guān)酶G6PASE、PEPCK和PGC1a的基因表達

采用Trizol一步法提取細胞總RNA，于含0.5 μg·ml-1EB的1%瓊脂糖凝膠電泳30 min(100 V)，檢測RNA有無降解。用紫外分光光度計測定RNA的含量和純度。每份樣品取1 μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行實時熒光定量PCR擴增。反應(yīng)結(jié)束后確認擴增曲線和溶解曲線，由電腦自動分析并計算出反應(yīng)體系中待測樣本cDNA達到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(Cycle Count，Ct)。根據(jù)Ct值比較基因的表達量。各目的基因表達水平差異的比較：變化倍率=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(Ct處理組目的基因-Ct處理組內(nèi)參基因)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因)。檢測肝組織中糖異生關(guān)鍵酶G6PASE、PEPCK和PGC1a的基因變化。

1.8 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用GraphPad 5.0進行分析，各組計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 成功建立NAFLD大鼠模型

兩組大鼠0、5、10、15、20 d隨機血糖無差異(P>0.05)，而25、30 d HFD組顯著高于CD組(P<0.05，圖1A)；HFD組大鼠30 d的胰島素水平顯著高于CD組(P<0.05，圖1B)。油紅O染色顯示HFD組肝組織有大量脂肪顆粒(圖1C)，HE染色顯示HFD組大鼠肝組織有大量空泡細胞(圖1D)，均為NAFLD的表現(xiàn)。上述結(jié)果表明，通過高脂飲食喂養(yǎng)30 d，HDF組大鼠成功構(gòu)建了NAFLD模型。

a P<0.05

2.2 肝靜脈血葡萄糖、胰島素代謝和肝糖原測定結(jié)果

繪制HFD組和CD組大鼠葡萄糖、胰島素代謝曲線(圖2A、B)及肝糖原存儲曲線(圖2C)，結(jié)果顯示，HFD組的葡萄糖、胰島素水平均顯著高于CD組(P<0.05)，而HFD組的肝糖原水平顯著低于CD組(P<0.05)。

a P<0.05

2.3 糖原合成蛋白和糖異生相關(guān)酶的基因表達

HFD組肝臟的糖原合成相關(guān)酶AKT和GSK3B的蛋白磷酸化(p-AKT和p-GSK3B)受到抑制(圖3A)，而HFD組糖異生相關(guān)酶基因G6PASE、PEPCK和PGC1a的表達水平則顯著高于CD組(P<0.05,圖3B)。

a P<0.05

4 討 論

肝臟作為物質(zhì)代謝、能量代謝和激素代謝的主要器官，接受經(jīng)門靜脈系統(tǒng)傳輸?shù)母鞣N物質(zhì)，包括葡萄糖和胰島素等。葡萄糖進入肝臟可以被氧化產(chǎn)能、合成糖原或進入肝靜脈；胰島素進入肝臟可以被肝細胞降解、合成肝糖原被消耗或進入肝靜脈。因此，檢測肝靜脈的葡萄糖和胰島素水平能反映肝臟的糖代謝狀態(tài)。本研究通過繪制NAFLD大鼠的葡萄糖、胰島素和糖原合成曲線，顯示HDF組的肝靜脈血糖和胰島素水平增高，表明NAFLD大鼠葡萄糖和胰島素的代謝能力降低，提示NAFLD大鼠出現(xiàn)了肝臟IR，肝靜脈血中增高的血糖和胰島素會進入全身循環(huán)，可能參與全身IR和2型糖尿病的發(fā)生。賴水青等[7- 9]研究發(fā)現(xiàn)，肝臟脂肪含量與IR、糖代謝異常發(fā)生密切相關(guān)；袁靜等[10]研究還發(fā)現(xiàn),高脂肪誘導(dǎo)的肝脂肪變性過程中，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP94表達升高，NAFLD合并糖代謝異常。本研究結(jié)果與之一致。

門靜脈血糖增高時，胰島素通過促進肝糖原合成、抑制糖異生兩個途徑控制葡萄糖，維持肝靜脈血糖的穩(wěn)定。本研究通過RT-PCR和Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，HFD組NAFLD的糖原合成相關(guān)酶的基因磷酸化水平較CD組明顯降低，肝臟糖異生酶的基因表達反而增強，從分子水平表明NAFLD時胰島素促進肝糖原合成和抑制糖異生能力均降低，從而導(dǎo)致肝靜脈血糖增高和肝糖原儲備減少。有研究發(fā)現(xiàn)糖異生調(diào)控的失衡是2型糖尿病的典型特征[11]，本研究發(fā)現(xiàn)NAFLD也存在糖異生調(diào)控失衡。針對NAFLD糖異生調(diào)控的基因靶點進行治療，也許是早期干預(yù)2型糖尿病的方法[12]。

本團隊前期病例對照研究和隊列研究結(jié)果顯示，NAFLD是2型糖尿病的獨立危險因素，NAFLD患者2型糖尿病的4年累積發(fā)病率是非NAFLD者的4.3倍[13- 14]，降低NAFLD的發(fā)病可以減少72.58%的2型糖尿病發(fā)病，已經(jīng)從流行病學研究上提示NAFLD與2型糖尿病有因果聯(lián)系[15- 18]。本研究通過動物實驗和分子生物學方法闡明NAFLD與2型糖尿病的內(nèi)在聯(lián)系，NAFLD肝臟調(diào)節(jié)葡萄糖、胰島素能力下降，肝糖原合成減少，導(dǎo)致高血糖和高胰島素血癥，引起IR并增加患2型糖尿病的危險。