王金海 朱宏陽(yáng) 李泳寧

(福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，福建 福州 350101)

細(xì)菌纖維素(Bacterial cellulose,BC)具有良好的生物相容性，水合度很高，韌性又強(qiáng)，作為抗菌敷料，有利于限制感染并能使傷口快速愈合，同時(shí)BC可以被滅菌，易于吸收滲出物并易于儲(chǔ)藏處理。因此，BC在治療皮膚損傷、防治傷口感染以及人工皮膚等方面具有廣泛的用途，是一種天然的創(chuàng)傷敷料[1-2]。ε-聚賴氨酸(ε-Polylysine,ε-PL)是由賴氨酸殘基通過(guò)ε-氨基和α-羧基構(gòu)成的肽鍵連接而成的高分子聚合物，是一種新型的具有較好抑菌功效的生物防腐劑[3]。由于ε-PL在人體內(nèi)可分解為人體必需的L-賴氨酸,因此ε-PL也是一種較高安全性的天然食品防腐劑,具有水溶性好、抗菌譜廣等特點(diǎn),具有潛在的商業(yè)利用價(jià)值[4]。目前我國(guó)已批準(zhǔn)ε-PL作為食品防腐劑應(yīng)用于熟肉制品、焙烤制品以及果蔬汁[5-6]。從應(yīng)用角度來(lái)講,ε-PL能否與其它物質(zhì)配合使用,同時(shí)提高ε-PL的抗菌活性是一個(gè)值得深入探討的問(wèn)題,學(xué)界對(duì)此也進(jìn)行了大量研究[7-8]。本研究在前期工作中以具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的BacillusamyloliquefaciensZF-7(保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)為：CGMCC No. 6266)為出發(fā)菌株[9]，將ε-PL均勻吸附在BC上制備獲得聚賴氨酸/細(xì)菌纖維素抗菌敷料PLBC，并通過(guò)對(duì)其細(xì)胞毒性、生物相容性及抗菌性能進(jìn)行檢測(cè)，篩選出合適濃度的抗菌敷料PLBC。

1 材料與方法

1.1 主要材料

ε-聚賴氨酸由南京軒凱生物科技有限公司提供，細(xì)菌纖維素由本實(shí)驗(yàn)室制備，新西蘭白兔及SPF級(jí)昆明種小鼠購(gòu)自于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005)，小鼠成纖維細(xì)胞L929和人胚肝細(xì)胞系L02細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供，實(shí)驗(yàn)菌株由南方醫(yī)科大學(xué)微生物研究所提供。

1.2 抗菌敷料PLBC的制備

將若干BC膜片(本實(shí)驗(yàn)組制備)浸泡于100mL一定濃度(0、0.5%、1.0%)PL溶液中，并將其置于超聲清洗器中超聲震蕩，使BC與PL能充分接觸吸附均勻，總吸附時(shí)間為1h，分3次重復(fù)震蕩，間隔時(shí)間10min。將吸附后的膜片放入濃度為15%甘油中，1～2s后迅速取出，取出后瀝干表面多余液體，于60℃烘箱烘干至恒重，供測(cè)試使用。

1.3 細(xì)胞毒性檢測(cè)

1.3.1 受試樣品浸提液制備

稱重受試敷料，嚴(yán)格高壓滅菌，用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋，使各無(wú)菌試管的敷料質(zhì)量濃度為100g/L,置37℃培養(yǎng)箱浸提48h。用微孔過(guò)濾器過(guò)濾后制成PLBC浸提液，置4℃冰箱保存，備用。以二甲基亞砜為陽(yáng)性對(duì)照、RPMI1640培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。

1.3.2 SRB法檢測(cè)PLBC體外對(duì)L02細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L02細(xì)胞，接種于96 孔板上，100 μL/孔，細(xì)胞數(shù)3000個(gè)/孔，靜置15 min。培養(yǎng)24 h 后，每孔加100 μL PLBC，終濃度分別為1.00、2.00、4.00、8.00mg/mL，陰性對(duì)照組加培養(yǎng)液100 μL/孔，陽(yáng)性對(duì)照組加5%的二甲基亞砜100 μL/孔，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。置常規(guī)培養(yǎng)條件下作用24 h后，電子顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，SRB染色液染色，用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.3.3 CCK-8法檢測(cè)PLBC體外對(duì)L929細(xì)胞活性的影響

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種濃度為2×105/mL的L929細(xì)胞懸浮液，種植15個(gè)孔，每組5個(gè)孔。培養(yǎng)24h后換液，分別在終濃度分別為1.00、2.00、4.00、8.00mg/mL PLBC組細(xì)胞培養(yǎng)，液液面滴1μL相對(duì)應(yīng)的浸提液，待浸提液凝固后形成的混合液中調(diào)整浸提液濃度為1%。作用24h后換液，接著每孔中加入100μL CCK-8試劑，用酶標(biāo)儀測(cè)量OD值，通過(guò)公式計(jì)算出細(xì)胞生長(zhǎng)活性。

1.4 急性全身毒性實(shí)驗(yàn)

取SPF級(jí)昆明種小鼠30只，體重約20g，雌雄各半，將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。無(wú)菌條件下，按1mL/20g劑量標(biāo)準(zhǔn)將PLBC浸提液注入實(shí)驗(yàn)組腹腔內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照組注入等量苯酚，陰性對(duì)照組注入等量生理鹽水。連續(xù)觀察14天，記錄小鼠注射后1d、7d、14d呼吸、進(jìn)食、毒性反應(yīng)、體重變化或死亡。

1.5 溶血度測(cè)定

耳緣靜脈抽兔血4mL，制成新鮮的抗凝稀釋兔血。取5mL實(shí)驗(yàn)組敷料浸提液置于離心管中，并用去離子水和生理鹽水設(shè)置陽(yáng)性與陰性對(duì)照組，每組6只管，置于恒溫水浴箱中0.5h。將制作好的兔血0.1mL滴入各組中，混勻，靜置恒溫水浴箱1h，離心5min，觀察各管顏色及溶血現(xiàn)象。分別取200μL各管中的上清液添加到96孔板中。酶標(biāo)儀測(cè)定各樣本OD值后計(jì)算出溶血度。

1.6 抗菌性能檢測(cè)

選用臨床常見(jiàn)三種菌株：大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作為實(shí)驗(yàn)用菌，采用抑菌圈法，將菌液均勻涂板后，在各板上貼附四種濃度PLBC敷料剪成直徑為10 mm 的小圓片，放置于細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h 后，計(jì)算抑菌圈大小。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SRB法檢測(cè)PLBC體外對(duì)L02細(xì)胞增殖的影響

培養(yǎng) 24 h 后，各濃度PLBC敷料組的細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)好，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，可見(jiàn)核分裂細(xì)胞。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞核固縮，細(xì)胞密度下降，死亡細(xì)胞多，少數(shù)貼壁細(xì)胞聚集成團(tuán)。SRB法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的PLBC(1.00、2.00、4.00、8.00mg/mL)作用于L02細(xì)胞24h的抑制率分別為95.67%±0.26%、94.34%±0.15%、94.92%±0.23%、92.19%±0.34%，P<0.01(表1)，根據(jù)國(guó)際醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)細(xì)胞活性必須高于70%的標(biāo)準(zhǔn)，PLBC的細(xì)胞毒性符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。

表1 各組敷料作用于L02細(xì)胞的細(xì)胞相對(duì)增殖率及毒性評(píng)價(jià)

2.2 CCK-8法檢測(cè)PLBC體外對(duì)L929細(xì)胞活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種不同敷料對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，其中BC組細(xì)胞活性為78.23%±5.18%，PLBC組為81.95%±3.57%，兩組敷料對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活性影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，詳見(jiàn)表2。因加入細(xì)胞培養(yǎng)液中任何非細(xì)胞培養(yǎng)所必需的物質(zhì)均會(huì)對(duì)細(xì)胞有不同程度的毒性作用，根據(jù)國(guó)際醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)細(xì)胞活性必須高于70%的標(biāo)準(zhǔn)，PLBC的細(xì)胞毒性符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。

表2 CCK-8法檢測(cè)PLBC間接接觸L929

2.3 急性全身毒性實(shí)驗(yàn)

各組小鼠體重增長(zhǎng)見(jiàn)表3，比較三組間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重變化，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組PLBC對(duì)小鼠生長(zhǎng)基本無(wú)影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而陽(yáng)性組小鼠體重增長(zhǎng)明顯減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性組各小鼠未見(jiàn)任何不良反應(yīng)，體重呈增加趨勢(shì)，無(wú)死亡；實(shí)驗(yàn)組各鼠活動(dòng)正常，未發(fā)現(xiàn)呼吸抑制、步態(tài)不穩(wěn)、驚厥等毒性反應(yīng)，無(wú)一死亡，體重呈增加趨勢(shì)。陽(yáng)性組第一天死亡3只，其他小鼠出現(xiàn)震顫、潮式呼吸，活動(dòng)下降，體重?zé)o明顯增加。

2.4 溶血實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組PLBC浸提液離心管和陰性對(duì)照管離心后，上清液均為無(wú)色透明液體，紅細(xì)胞沉積管底，無(wú)明顯溶血現(xiàn)象。陽(yáng)性對(duì)照組液體則呈艷粉色，底部未見(jiàn)明顯沉積，可見(jiàn)紅細(xì)胞破裂溶解。采用單因素方差分析比較三組間的吸光度值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，兩兩比較提示各組間均有差異(P<0.01)，如表4所示。

表3 急性全身毒性實(shí)驗(yàn)小鼠的體重變化 單位:g

表4 各組材料OD值及溶血率

2.5 抗菌性能檢測(cè)

抑菌圈提示，4組不同濃度的PLBC敷料其抑菌圈大小呈濃度依賴性，而B(niǎo)C組敷料在三個(gè)菌株中均未見(jiàn)明顯抑菌圈。在對(duì)三個(gè)菌株的抑菌圈中，不同濃度(1.00、2.00、4.00、8.00mg/mL)的PLBC所產(chǎn)生的抑菌圈大小分別為10.7～12.2mm、12.9～13.6mm、13.8～14.5mm、14.7～16.1mm)(圖1)。

圖1 五組敷料對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的抑菌圈柱形圖比較

抑菌圈檢測(cè)法反映了PLBC與微生物直接接觸后的抑制性能，真正發(fā)揮抗菌作用的是吸附在纖維上的聚賴氨酸，其抗菌能力隨聚賴氨酸濃度升高而增加，而細(xì)菌纖維素作為敷料載體，本身并不具有抗菌性能。

3 討論

促進(jìn)創(chuàng)面愈合是外科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)課題，如何有效防止創(chuàng)面感染是其重點(diǎn)研究方向。保護(hù)創(chuàng)面、防止并治療創(chuàng)面感染及加快創(chuàng)面愈合，已成為促創(chuàng)面愈合的研究熱點(diǎn)[10-11]。治療創(chuàng)面的常規(guī)方法是用可覆蓋創(chuàng)面并能殺滅病菌及促進(jìn)傷口愈合的敷料覆蓋，不僅能為促進(jìn)傷口愈合提供良好的微環(huán)境，還能有效防止感染、減少并發(fā)癥。近幾十年來(lái)，醫(yī)用抗菌敷料研究發(fā)生了突破性的發(fā)展，尤其是生物基醫(yī)用抗菌敷料獲得突飛猛進(jìn)的進(jìn)展[12-13]。現(xiàn)如今生物基醫(yī)用抗菌敷料是在創(chuàng)傷修復(fù)“濕潤(rùn)愈合”理論基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型材料，與傳統(tǒng)敷料相比，其具有加速創(chuàng)面愈合、提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量、降低感染、避免創(chuàng)面粘連、減輕患者痛苦及方便使用等特點(diǎn)[14]。

BC因其具有超細(xì)纖維、高結(jié)晶度、高純度、高持水性、良好的機(jī)械性能、良好的生物相容性及生物可降解性，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，已成為極具潛力的新材料[15]。ε-PL在人體內(nèi)可分解為人體必需的賴氨酸，是一種營(yíng)養(yǎng)型抑菌劑，其安全性優(yōu)于其他化學(xué)抑菌劑[16]。本研究將ε-PL吸附在BC中制備獲得聚賴氨酸/細(xì)菌纖維素抗菌敷料PLBC，評(píng)價(jià)材料的細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)方法有很多種，其中CCK-8具有簡(jiǎn)便、靈敏、快速等特點(diǎn)，結(jié)果客觀性強(qiáng)、重復(fù)性好，是目前體外評(píng)價(jià)生物材料增殖活性的最常用方法[17]。SRB法具備MTT法操作簡(jiǎn)便、敏感的特點(diǎn),同時(shí)測(cè)量結(jié)果不受時(shí)間影響,尤其適用于大規(guī)模藥物篩選及毒性評(píng)價(jià)[18]。L02細(xì)胞是人胚肝細(xì)胞，是細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞之一[19-20]。 本研究通過(guò)采用SRB法和CCK-8法檢測(cè)抗菌敷料PLBC，根據(jù)國(guó)際醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)之體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)細(xì)胞活性必須高于70%的標(biāo)準(zhǔn)，PLBC的細(xì)胞毒性在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，其細(xì)胞毒性符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。醫(yī)用生物敷料的溶血實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)材料體外溶血活性、鑒定生物相容性的最基本實(shí)驗(yàn)之一。本研究采用溶血實(shí)驗(yàn)及全身毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PLBC，發(fā)現(xiàn)其不引起溶血反應(yīng)，無(wú)急性全身毒性反應(yīng)，具有良好的生物相容性。微生物檢定法中測(cè)定藥物效價(jià)常用抑菌圈法，通過(guò)抑菌圈的大小來(lái)直觀展示藥物效價(jià)[21]。本研究通過(guò)抑菌圈法測(cè)定不同濃度的PLBC及空白組對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌三種菌株的抑菌性能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BC本身不具備抗菌性能，PLBC的抑菌性能由吸附于BC的PL發(fā)揮，且抑菌性能隨PL濃度升高而增加。

本實(shí)驗(yàn)制備的聚賴氨酸/細(xì)菌纖維素抗菌敷料PLBC體外無(wú)明顯細(xì)胞毒性，體內(nèi)不引起溶血反應(yīng)，無(wú)急性全身毒性反應(yīng)，具有良好的生物相容性及抗菌性能，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌等臨床常見(jiàn)菌株均有明顯的抑制作用且呈濃度依賴性，因此是一種理想的抗菌敷料。