鵝骨膠原蛋白鈣螯合肽的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

周名洋，何雨欣，孫楊贏，潘道東，曹錦軒

（寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室，浙江 寧波 315800）

金屬離子在許多代謝過程中起著重要作用，如穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和控制氧化還原進(jìn)程等。在所有的二價金屬離子中，鈣離子的作用尤為突出，如提供骨架和充當(dāng)信使等。缺鈣會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、高血壓和腸癌等疾病[1]，嚴(yán)重危害人們的身體健康。如今人口老齡化嚴(yán)重，缺鈣人群比例大，離子鈣是主要的補鈣劑，但它會在腸道形成磷酸鈣沉淀，生物利用度較低[2]。近年來有機(jī)鈣補劑如鈣螯合肽已經(jīng)成為研究熱點[3]，這些小分子肽耗能少、轉(zhuǎn)運速度快，而且是不易飽和的載體[4]，應(yīng)用前景廣泛。目前，國內(nèi)外很多學(xué)者已從大豆、羅非魚、鱈魚、蝦、豬血漿等食源性原料中分離得到具有鈣螯合功能的生物活性肽[5-10]。

鵝骨是鵝肉加工過程中的副產(chǎn)物，營養(yǎng)豐富，其蛋白質(zhì)含量豐富，約為17%[11]。研究表明90%以上的骨蛋白是膠原蛋白[12]，而幾乎所有骨膠原都是I型膠原蛋白[13]。蔣金利等[14]研究發(fā)現(xiàn)小分子鵝骨膠原多肽可以有效促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及向成骨細(xì)胞分化，從而起到抑制骨質(zhì)疏松的作用。然而，從鵝骨膠原蛋白水解物中分離純化出特定的鈣螯合肽的研究卻鮮有報道。

本研究以鵝骨膠原蛋白為原料，采用堿性蛋白酶制備鈣螯合肽，通過現(xiàn)代色譜分離技術(shù)進(jìn)行純化，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）、紫外光譜（ultroviolet spectroscopy，UV）和傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）測定其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)，合成結(jié)構(gòu)明確的鵝骨膠原蛋白活性肽，并對其活性進(jìn)行驗證。為鵝骨膠原肽補鈣劑的制備、結(jié)構(gòu)解析和補鈣機(jī)理研究提供一定的實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鵝骨膠原蛋白（純度約90%）由實驗室自制；堿性蛋白酶 索萊寶生物科技有限公司；水合茚三酮（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、三氟乙酸（均為色譜級） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；0.22 μm濾膜 海門市康健實驗器材廠；SephadexG-25美國GE公司；聚乙二醇 美國Particle Sizing Systems公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H H-4 恒溫水浴鍋 蘇州威爾實驗用品有限公司；1515凝膠滲透色譜儀 美國Waters公司；ALPHA2-4LSCp冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；NexION 2000電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）儀 美國PerkinElmer公司；LC-MS/MS儀 加拿大SCIEX公司；Tecan infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鵝骨膠原蛋白的酶解

鵝骨膠原蛋白的酶解參考Feng Mengmeng等[15]的方法。稱取1.0 g凍干的鵝骨膠原蛋白，用去離子水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鵝骨膠原蛋白溶液，90 ℃加熱10 min，用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0。酶解條件：溫度55 ℃、pH 8.0、堿性蛋白酶與鵝骨膠原蛋白質(zhì)量比1∶50，時間6 h，酶解過程中每15 min用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值，并維持至pH值恒定。酶解結(jié)束后將酶解液立即放置于95 ℃沸水中滅酶10 min，冷卻至室溫，3 000×g離心10 min，取上清液低溫冷凍干燥，得到鵝骨膠原蛋白酶解凍干粉，－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 水解度的測定

采用茚三酮比色法[16]測定鵝骨膠原蛋白的水解度。水解度計算公式如下：

式中：0.17 mmol/g為鵝骨膠原蛋白中游離氨基的含量；5.79為膠原蛋白折算系數(shù)[17]；N為原料中的氮含量；7.6 mmol/g為鵝骨膠原蛋白水解度常數(shù)。

水解液中游離氨基含量通過甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到，原料中氨基含量通過凱氏定氮法計算得到[17]。鵝骨膠原蛋白水解度常數(shù)是參考謝麗蒙等[18]的方法，根據(jù)氨基酸組成含量計算得出。

1.3.3 鵝骨膠原蛋白及酶解物中氨基酸組成測定

采用氨基酸自動分析儀測定鵝骨膠原蛋白和酶解物的氨基酸組成。取1.0 g的鵝骨膠原蛋白及其酶解物于玻璃試管中，加入6 mol/L HCl溶液，試管抽真空，置于110 ℃恒溫干燥箱內(nèi)水解24 h。用氨基酸自動分析儀測定[19]。

1.3.4 分子質(zhì)量分布的測定

采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）法測定鵝骨膠原蛋白酶解后分子質(zhì)量分布。

樣品制備：取0.3 g鵝骨膠原蛋白酶解物放入5 mL的樣品瓶中，加入含0.1 mol/L硝酸鈉的超純水，超聲分散后待測。

色譜條件：1515高效液相色譜儀，色譜柱包括Ultrahydrogel 120 Pkgd、Ultrahydrogel 250 Pkgd和Ultrahydrogel 500 Pkgd，Waters 2414示差折光檢測器，以含0.1 mol/L硝酸鈉的超純水為流動相，35 ℃條件下以1 mL/min流速洗脫，標(biāo)準(zhǔn)品為窄分布聚乙二醇，分子質(zhì)量分別為330 000、176 000、82 500、44 000、25 300、20 600、12 600、7 130、4 290、1 400、633 u和430 u。

1.3.5 鈣螯合量測定

鵝骨膠原多肽的鈣螯合活性的測定參考Cao Yong等[20]的方法。分別稱取適量1.3.1節(jié)冷凍干燥后的鵝骨膠原多肽粉、無水CaCl2和Na2HPO4，加入一定量蒸餾水，混勻，最終使鵝骨膠原多肽、無水CaCl2和Na2HPO4濃度分別為1 mg/mL、5 mmol/L和0.2 mol/L，調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0，在37 ℃水浴中攪拌2 h，10 000×g離心10 min，取上清液，通過ICP-MS測定上清液鈣離子濃度，同時做空白對照。鈣螯合量計算公式如下：

1.3.6 Sephadex G-25

凝膠過濾色譜將鵝骨膠原蛋白酶解物進(jìn)行Sephadex G-25葡聚糖凝膠分離純化，柱型：1.6 cm×60 cm，樣品質(zhì)量濃度100 mg/mL，上樣量為0.5 mL，洗脫速率0.4 mL/min，檢測波長220 nm，分別收集各組分，凍干后測定鵝骨膠原蛋白酶解物鈣螯合活性。

1.3.7 反向高效液相色譜

將Sephadex G-25分離獲得的具有較高鈣螯合能力的活性肽進(jìn)一步經(jīng)1260高效液相色譜儀純化，選用ZORBAX Eclipse XDB C18（150 mm×21.2 mm，7 mm）色譜柱。流動相A：水（含0.05%三氟乙酸）；流動相B：乙腈（含0.05%三氟乙酸），樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL，上樣量100 μL，檢測波長214 nm，流速1 mL/min，洗脫條件：100%～80% A，0%～20% B，20 min；80%～75% A，20%～25% B，70 min；75%～10% A，25%～90% B，5 min；10%～85% A，90%～15% B，5 min；85% A，15% B，15 min。每次洗脫結(jié)束平衡色譜柱30 min，按圖譜收集各組分。

1.3.8 鈣螯合肽序列

通過LC-MS/MS測定鵝骨膠原蛋白鈣螯合肽的分子質(zhì)量和氨基酸序列。

使用SCIEX公司的TripleTOF 5600液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜分析。C18捕獲柱：5 mm×0.3 mm，5 μm，分析柱：75 μm×150 mm，3 μm，線性梯度分離：0 min，95% A，5% B；15 min，95%～65% A，5%～35% B；1 min，65%～20% A，35%～80% B；5 min，20% A，80% B；0.1 min，20%～95% A，80%～5% B；8.9 min，95% A，5% B。流動相A：3%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、97%水，0.1%甲酸；流動相B：3%DMSO、97%乙腈、0.1%甲酸。柱流速為300 nL/min。

質(zhì)譜IDA模式分析時，每個掃描循環(huán)中包含一個MS全掃描（m/z350～1 500，離子累積時間250 ms），以及40 個MS/MS掃描（m/z100～1 500，離子累積時間50 ms）。MS/MS采集的條件為母離子信號大于120 cps，電荷數(shù)為＋2～＋5。離子重復(fù)采集的排除時間為18 s。

TripleTOF 5600 產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Mascot Daemon（V2.3.2）進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)如下：Type of search選擇MS/MS Ion Search；Fixed modifications選Carbamidomethyl；Variable modifications選擇Acetyl、Deamidated、Oxidation；Digestion選Trypsin。檢索結(jié)果以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.3.9 肽的合成及驗證

經(jīng)質(zhì)譜鑒定的多肽由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成肽的純度和分子質(zhì)量分別通過反向高效液相色譜配備SHIMADZU Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）和電噴霧電離質(zhì)譜測定，并通過1.3.5節(jié)中方法測定合成多肽的鈣螯合活性。

1.3.10 UV分析

將鵝骨膠原肽和肽鈣螯合物溶于磷酸鹽緩沖液，配制成合適濃度，通過UV分析鵝骨膠原肽、鈣螯合反應(yīng)的主要位點，掃描波長范圍200～400 nm。

1.3.11 FTIR分析

參考Hasni等[21]的方法稍加修改。在研缽中加入約1 mg的樣品，再加入100 mg干燥KBr充分研磨成粉末狀，混勻。用FTIR分析鵝骨膠原肽鈣螯合位點，波長范圍400～4 000 cm－1。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 18.0進(jìn)行ANOVA分析，圖形制作采用Origin 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝骨膠原蛋白酶解

堿性蛋白酶酶解制備的鵝骨膠原蛋白鈣螯合肽，水解度高達(dá)52.17%，鵝骨膠原蛋白酶解液的鈣螯合活性為48.97 mg/g。Narin等[3]制備的羅非魚肉蛋白鈣螯合肽，酶解6 h水解度最大，達(dá)到47.8%，此時鈣螯合活性為40～50 mg/g，與本實驗結(jié)果相似。鵝骨膠原蛋白酶解物具有較高的鈣螯合活性，可用于進(jìn)一步的分離純化。

2.2 氨基酸組成分析

鵝骨膠原蛋白及酶解物的氨基酸組成如表1所示。鵝骨膠原蛋白總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為80.98%，酶解后總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升達(dá)到91.43%。鵝骨膠原蛋白中Gly質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，約為29%，Pro次之，為9.53%，符合膠原蛋白的氨基酸特征[22]，人體必需氨基酸占氨基酸總量的11.18%；鵝骨膠原酶解物中含量最高的也是Gly，但含量比酶解前低，約為24%，Glu的質(zhì)量分?jǐn)?shù)次之，為12.67%，各種人體必需氨基酸的含量均增大，總量高達(dá)24.94%。Liu Fengru等[23]發(fā)現(xiàn)Glu、Asp、Ser、Thr、Met和Tyr等對鈣離子鰲合活性貢獻(xiàn)較大，而這些氨基酸在鵝骨膠原蛋白中含量豐富，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到20.71%，說明鵝骨膠原蛋白是制備鈣鰲合肽的良好來源，酶解后膠原多肽中這些氨基酸的含量均升高，總量高達(dá)35.05%，說明鵝骨膠原蛋白酶解物具有良好的鈣螯合活性。

表1 鵝骨膠原蛋白及多肽氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of collagen and collagen peptides from goose bone

2.3 鵝骨膠原蛋白酶解物分子質(zhì)量分布

圖1 鵝骨膠原蛋白酶解物GPC（A）聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）Fig. 1 GPC profile of goose bone collagen hydrolysate (A) and standard curve of polyethylene glycol (B)

表2 鵝骨膠原蛋白酶解物分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular mass distribution of goose bone collagen hydrolysate

如圖1所示，A為鵝骨膠原蛋白酶解物GPC，結(jié)合B聚乙二醇分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到鵝骨膠原蛋白酶解物的分子質(zhì)量分布，如表2所示，分子質(zhì)量低于7 000 u的鵝骨膠原肽占總體的85.54%，分子質(zhì)量在3 000 u以下的占總體的64.96%。研究表明，小分子多肽具有更高的生物活性，易被人體吸收[24]，而且多肽的分子質(zhì)量大小也能影響金屬螯合活性[25]，Jiang等[26]研究了卵黃高磷蛋白肽分子質(zhì)量與鈣螯合活性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)1 000～3 000 u的組分的鈣螯合活性高于酪蛋白磷酸肽，Liu Fengru等[23]也有相似的發(fā)現(xiàn)，在不同分子質(zhì)量麥胚蛋白肽組分中，低于2 000 u的組分，鈣螯合活性最高。分子質(zhì)量大小對多肽鈣螯合活至關(guān)重要，這也解釋了凝膠純化的組分鈣螯合能力顯著高于鵝骨膠原蛋白酶解物的原因。

2.4 鵝骨膠原蛋白鈣螯合肽的分離純化

圖2 SephadexG-25凝膠過濾色譜Fig. 2 Sephadex G-25 gel filtration chromatogram

如圖2所示，鵝骨膠原蛋白酶解物經(jīng)SephadexG-25凝膠柱洗脫得到2 個組分，即F1和F2。收集各組分凍干，進(jìn)行鈣螯合活性驗證。由表3可知，組分F1具有較高的鈣螯合能力（55.84 mg/g），顯著高于F2（P＜0.05），因此，選擇組分F1進(jìn)行液相分離。

表3 鵝骨膠原肽鈣螯合活性Table 3 Calcium-chelating activity of goose bone collagen peptides

圖3 反向高效液相色譜Fig. 3 Reverse high-performance liquid chromatogram

如圖3所示，SephadexG-25純化組分F1經(jīng)反向高效液相色譜分離圖譜，0～10 min內(nèi)出現(xiàn)的是溶劑峰，而樣品峰主要集中在95～125 min內(nèi)，樣品峰中雜峰少，說明經(jīng)Sephadex G-25純化后的樣品純度較高，分別收集2 個洗脫峰F1-1和F1-2。通過鈣螯合實驗，發(fā)現(xiàn)峰F1-1的鈣螯合活性更強(qiáng)，達(dá)到65.19 mg/g顯著高于F1-2（P＜0.05），因此收集組分F1-1。

2.5 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

圖4 DSYVGDAQSKR和KLLDGR二級質(zhì)譜圖Fig. 4 Tandem mass spectra of DSYVGDEAQSKR and KLLDEGR

將F1-1組分進(jìn)行LC-MS/MS鑒定，通過搜索NCBI水禽蛋白數(shù)據(jù)庫、Mascot比對質(zhì)譜和可信度分析，從鑒定結(jié)果中選擇氨基酸序列為DSYVGDEAQSKR和KLLDEGR的活性肽作為鵝骨膠原蛋白鈣螯合肽，分子質(zhì)量分別為1353.62u和829.47u，如圖4所示。 DSYVGDEAQSKR和KLLDEGR來源于tr|U3IRK7|U3IRK7_ANAPL（41-52）和tr|U3I3T1|U3I3T1_ANAPL（123-129）。

將DSYVGDEAQSKR和KLLDEGR進(jìn)行化學(xué)合成，純度為98.24%和97.19%。對合成肽進(jìn)行鈣螯合活性驗證，鈣螯合能力分別為70.08 mg/g和68.18 mg/g，均顯著高于（P＜0.05）鵝骨膠原蛋白酶解物的鈣螯合量，活性肽中酸性氨基酸的含量高，具有更好的鈣螯合活性。Huang Shunli等[27]從乳清蛋白水解產(chǎn)物中分離得到分子質(zhì)量為204 u的二肽EG，鈣螯合能力為67.81 μg/mg；Jeon等[28]從小球藻蛋白水解物中分離純化得到序列為NSGC的鈣螯合肽，鈣螯合能力為0.166 mmol/L；Wang Li等[29]從小麥胚芽蛋白水解物中分離得到了一種新型鈣螯合肽FVDVT，鈣螯合能力高達(dá)（89.94±0.75）%。這些鈣螯合肽的分子質(zhì)量均低于3 000 u，且氨基酸序列中含有Asp、Glu、Ser和Thr。Kumagai等[30]和Liu Fengru等[23]研究發(fā)現(xiàn)Asp和Glu是主要的鈣螯合位點，此外Ser、Thr、Met和His等也對鈣離子螯合活性貢獻(xiàn)較大。

2.6 UV分析

圖5 鵝骨膠原蛋白鈣螯合肽及其鈣螯合物的UV圖Fig. 5 UV absorption spectra of calcium-chelating peptide from goose bone collagen and peptide-calcium chelate

如圖5所示，鈣離子加入后，鵝骨膠原肽的UV發(fā)生顯著變化，說明鵝骨膠原肽與鈣離子發(fā)生了螯合反應(yīng)。在210 nm波長附近出現(xiàn)最大吸收峰，這說明鵝骨膠原肽中存在羧基、羰基和肽鍵，在與鈣離子螯合后，最大吸收峰的吸收強(qiáng)度降低，出現(xiàn)減色效應(yīng)，這可能是羧基和氨基與鈣離子螯合作用的結(jié)果。這與Liu Guo等[31]的研究結(jié)果一致。

2.7 FTIR分析

如圖6所示，酰胺有2 個最重要的振動模式，分別是酰胺I帶（C＝O伸縮振動，1 690～1 630 cm-1）和酰胺II帶（N—H彎曲振動（40%～60%）和C—N伸縮振動（18%～40%），1 655～1 590 cm-1）[32]。鵝骨膠原肽DSYVGDEAQSKR、KLLDEGR的酰胺I帶和酰胺II帶的峰值分別為1 655.59、1 547.59 cm-1和1 667.16、1 541.82 cm-1。鈣離子加入后，鵝骨膠原肽鈣螯合物的酰胺I帶和酰胺II帶發(fā)生紅移，峰值變小為1 638.23、1 544.70 cm-1和1 638.23、1 617.98 cm-1，可能是鵝骨膠原肽氨基酸殘基上的羧基參與鈣螯合。鵝骨膠原肽鈣螯合物的N—H鍵波數(shù)分別為3 465.46 cm-1和3 413.19 cm-1高于鵝骨膠原肽的N—H鍵波數(shù)3 290.93 cm-1和3 284.18 cm-1，可能是鈣離子的加入影響了鵝骨膠原肽的N—H鍵，使N—H鍵發(fā)生了藍(lán)移。推測鵝骨膠原肽主要通過氨基酸殘基上的羧基和氨基螯合鈣離子。這與Hu Huo[33]和Liu Fengru[23]等的結(jié)果相似。

圖6 鵝骨膠原蛋白鈣螯合肽及其鈣螯合物的FTIR圖Fig. 6 Infrared spectra of calcium-chelating peptide from goose bone collagen and peptide-calcium chelate

3 結(jié) 論

本研究從鵝骨膠原多肽中分離篩選純化出鈣螯合活性肽DSYVGDEAQSKR、KLLDEGR，分子質(zhì)量分別為1 353.62、829.47 u，鈣螯合量分別為70.08 mg/g和68.18 mg/g，鈣螯合活性良好。氨基酸分析表明鵝骨膠原多肽富含Glu（12.67%）和Asp（7.47%）。UV和FTIR結(jié)果表明鵝骨膠原肽DSYVGDEAQSKR、KLLDEGR主要通過氨基酸殘基上的羧基和氨基與鈣離子螯合。