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(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系化學(xué)教研室,鄭州 451191)

鄰苯二甲醛(OPA)是雙醛基芳香化合物,具有腐蝕性小和毒性低等優(yōu)點(diǎn),是醫(yī)院消化內(nèi)鏡首選消毒劑[1]。文獻(xiàn)[2]研究了4種市售OPA消毒劑的細(xì)菌芽孢殺滅效果,其中3種OPA消毒劑在作用300 min的殺滅對(duì)數(shù)仍不理想。文獻(xiàn)[3]將苯扎溴銨作為增效成分,與OPA復(fù)配后制備了季銨鹽復(fù)合消毒液,改變了單一OPA作用時(shí)殺滅細(xì)菌芽孢速度慢的缺點(diǎn)。文獻(xiàn)[4]認(rèn)為復(fù)合消毒液中的苯扎溴銨能夠附著在菌體表面,改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性和滲透壓,使OPA更易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,從而增強(qiáng)了細(xì)菌芽孢殺滅效果。苯扎溴銨和OPA的配比會(huì)影響這種復(fù)合消毒液的殺菌效果,因此,需要建立一種可以同時(shí)測(cè)定這兩種物質(zhì)含量的方法,以控制生產(chǎn)過程中兩者的含量和配比。但是,由于復(fù)合消毒液的基質(zhì)較為復(fù)雜,目前還未見可供參考的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)方法。

現(xiàn)行的《消毒技術(shù)規(guī)范》[5]采用滴定法測(cè)定苯扎溴銨的含量,但沒有規(guī)定OPA的測(cè)定方法;文獻(xiàn)[6]中采用滴定法,分光光度法和液相色譜法測(cè)定了OPA含量。其中,滴定法和分光光度法僅適用于簡(jiǎn)單基體消毒劑中單一組分含量的測(cè)定?；谙确蛛x后定量的高效液相色譜法(HPLC)是測(cè)定復(fù)合消毒劑中多組分含量的可靠方法[7]。目前國(guó)外文獻(xiàn)多采用有機(jī)試劑將OPA衍生后,再用HPLC對(duì)其進(jìn)行測(cè)定[8],該方法靈敏度高,適用于醫(yī)療產(chǎn)品表面殘留的痕量OPA測(cè)定,但存在衍生步驟復(fù)雜,精密度和回收率較差等缺點(diǎn)。市售消毒產(chǎn)品中OPA含量一般在0.50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))以上,季銨鹽殺菌液中苯扎溴銨的質(zhì)量濃度通常為500 mg·L-1,含量均較高,屬于微量分析,無(wú)需進(jìn)行衍生,直接采用HPLC即可滿足測(cè)試要求。因此,本工作采用HPLC測(cè)定了季銨鹽復(fù)合消毒液中的苯扎溴銨和OPA含量,以期為生產(chǎn)過程中苯扎溴銨和OPA含量的監(jiān)控提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Alliance 269型高效液相色譜儀;CT 15RE型高速離心機(jī)。

苯扎溴銨標(biāo)準(zhǔn)溶液:10.9 g·L-1。

苯扎溴銨標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:2.0 g·L-1,量取苯扎溴銨標(biāo)準(zhǔn)溶液1.83mL,用水定容至10.0mL。

OPA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:2.0 g·L-1,稱量0.2 g OPA標(biāo)準(zhǔn)品,用水溶解并定容至100.0mL,超聲輔助混合均勻。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量苯扎溴銨和OPA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用水稀釋,配制成苯扎溴銨和OPA質(zhì)量濃度分別為10.0,20.0,50.0,100.0,200.0,400.0,800.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

OPA標(biāo)準(zhǔn)品純度不小于98%;甲醇為色譜純,其他試劑為優(yōu)級(jí)純或分析純;試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相為體積比為1∶1的0.02 mol·L-1的乙酸-乙酸銨緩沖溶液(pH 4.5)和甲醇,等度洗脫;色譜柱溫度30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)263 nm;進(jìn)樣體積10μL;流量1.0mL·min-1。

1.3 試驗(yàn)方法

取1.0mL樣品于10mL容量瓶中,用流動(dòng)相定容至刻度,渦旋混合5 min后過0.45μm濾膜,濾液按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

為了得到苯扎溴銨和OPA的最佳檢測(cè)波長(zhǎng),試驗(yàn)選擇在190～400 nm內(nèi),對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外-可見光譜掃描,結(jié)果見圖1。

圖1 苯扎溴銨和OPA的紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of UV-Vis of benzalkonium bromide and OPA

由圖1可知:OPA的特征吸收波長(zhǎng)在263 nm附近;苯扎溴銨的特征吸收波長(zhǎng)在220,263,300 nm處。其中263 nm為苯扎溴銨和OPA的共同特征波長(zhǎng),且此處的背景吸收和噪音干擾較小、檢測(cè)靈敏度較高且抗干擾能力較強(qiáng),故選擇在263nm處測(cè)定苯扎溴銨和OPA。

2.1.2 色譜柱

在色譜柱選擇方面,美國(guó)藥典[9]和中國(guó)藥典[10]分別推薦采用氰基柱和C18色譜柱分離苯扎溴銨,而氰基柱和C18色譜柱都可用來(lái)分離OPA。因此,試驗(yàn)考察了分別采用氰基柱和C18色譜柱作為色譜柱時(shí)對(duì)苯扎溴銨和OPA色譜分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):以氰基柱為色譜柱分離時(shí),苯扎溴銨保留時(shí)間的重現(xiàn)性不好,測(cè)定結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性;以C18色譜柱分離時(shí),苯扎溴銨和OPA色譜分離效果均較好,故試驗(yàn)選擇采用C18色譜柱分離季銨鹽復(fù)合消毒液中的兩種有效成分。

2.1.3 流動(dòng)相組成

苯扎溴銨是極性陽(yáng)離子表面活性劑,易與C18色譜柱固定相中殘存的硅醇基形成氫鍵,造成色譜峰拖尾現(xiàn)象。文獻(xiàn)[11-14]在流動(dòng)相中加入庚烷磺酸鈉離子對(duì)試劑,通過磺酸根陰離子與季銨鹽陽(yáng)離子締合成中性離子對(duì)改善了苯扎溴銨在C18色譜柱上的保留性能,但是離子對(duì)試劑會(huì)在色譜柱的固定相上產(chǎn)生不可逆吸附,損傷色譜柱。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn),試驗(yàn)選擇體積比為1∶1的乙酸-乙酸銨緩沖溶液(pH 4.5)和甲醇為流動(dòng)相,其中的乙酸根陰離子可與季銨鹽陽(yáng)離子形成中性化合物,增加苯扎溴銨在色譜柱上的保留;而乙酸-乙酸銨緩沖溶液可保持流動(dòng)相的酸度穩(wěn)定和一定離子強(qiáng)度,從而達(dá)到改善目標(biāo)物峰型,減少色譜峰拖尾的目的。

優(yōu)化后的色譜條件見1.2節(jié),按此條件得到的樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖2。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution and sample

由圖2可知:在優(yōu)化的色譜條件下,混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在10 min內(nèi)即可達(dá)到基線分離,OPA和苯扎溴銨的色譜峰峰形對(duì)稱且無(wú)拖尾現(xiàn)象,保留時(shí)間分別為4.3,7.1 min。樣品中的苯扎溴銨和OPA也得到了基線分離,且其保留時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的基本一致(相對(duì)偏差小于1.0%)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以苯扎溴銨和OPA的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn),苯扎溴銨和OPA標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均為10.0～800.0 mg·L-1,線性回歸方程分別為y＝8.730×103x＋6.820×102和y＝2.750×104x＋1.310×103,線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 0,0.999 5。

按照儀器工作條件分別對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品空白進(jìn)行測(cè)定,以3倍信噪比(S/N)計(jì)算苯扎溴銨和OPA儀器檢出限和方法檢出限,所得結(jié)果分別為3.0,2.0 mg·L-1和5.0,3.5 mg·L-1。

2.3 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)3種季銨鹽復(fù)合消毒液樣品進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品平行測(cè)定7次,計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。其中,3種季銨鹽復(fù)合消毒液樣品中OPA的標(biāo)示值為0.35%～0.55%,苯扎溴銨的標(biāo)示值為不小于330 mg·L-1。

取10mL樣品于100mL錐形瓶中,分別加入苯扎溴銨標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.82,1.64,4.92mL和OPA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.0,2.0,5.0mL,混合均勻后,轉(zhuǎn)移至100mL的容量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,按照儀器工作條件測(cè)定,每個(gè)濃度水平平行測(cè)定3次,計(jì)算低、中、高等3個(gè)濃度水平的回收率,均平均值,所得結(jié)果見表1。

表1 樣品分析結(jié)果(n＝7)Tab.1 Analytical results of samples(n＝7)

由表1可以看出:樣品中的苯扎溴銨和OPA的測(cè)定值與標(biāo)示值相符;苯扎溴銨和OPA測(cè)定值的RSD均小于1.0%;苯扎溴銨的回收率為93.7%～95.2%,OPA的回收率為94.5%～98.5%。該方法選擇HPLC同時(shí)測(cè)定季銨鹽復(fù)合消毒液中的苯扎溴銨和OPA含量。該方法前處理簡(jiǎn)單、精密度和準(zhǔn)確度均較高,適用于季銨鹽復(fù)合消毒液產(chǎn)品中苯扎溴銨和OPA含量的同時(shí)測(cè)定。