桂紹濤，趙 暉，熊 磊，羅 韜，雷 銀，吳汶釗

外泌體是由機(jī)體活細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞-融合-外排等生物學(xué)機(jī)制產(chǎn)生的納米級(jí)囊泡，通過(guò)后期向內(nèi)出芽形成多囊泡體，再通過(guò)多囊泡體與質(zhì)膜融合釋放至細(xì)胞外[1]，具有雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，直徑30～150 nm[2-3]，甚至可達(dá)200 nm[4]。外泌體首次于1983年由Johnstone在羊的成熟紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，其在透射電子顯微鏡下常表現(xiàn)為杯狀或雙凹碟狀，密度在蔗糖濃度梯度及碘二甲醇濃度梯度中分別為1.10～1.21 g/ml和1.10～1.12 g/ml[5-6]。外泌體表面分子通過(guò)囊泡黏附至受體細(xì)胞表面的脂質(zhì)和配體，使整個(gè)囊泡內(nèi)化到受體細(xì)胞，外泌體膜與受體細(xì)胞的質(zhì)膜融合，從而促進(jìn)與其他細(xì)胞的相互作用[7]。存在于體液中的外泌體在細(xì)胞信息交換中起重要作用，其與受體細(xì)胞之間存在3種作用機(jī)制[8]：①外泌體與受體細(xì)胞融合，并將其內(nèi)容物傳送至細(xì)胞質(zhì)溶膠中[9]；②外泌體的跨膜蛋白可直接與靶細(xì)胞的信號(hào)受體相互作用[10]；③外泌體被內(nèi)化到受體細(xì)胞并出現(xiàn)下列情況，即部分被吞噬的外泌體可以合并形成內(nèi)體并經(jīng)歷轉(zhuǎn)胞吞作用將外泌體再次釋放至鄰近細(xì)胞，而部分被吞噬的外泌體形成的內(nèi)體可成熟為溶酶體并降解[11-12]。本文以女性生殖道外泌體在精子成熟與胚胎發(fā)育中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 女性生殖道外泌體的分離與鑒定

選擇分離和純化的具體方法應(yīng)考慮樣品來(lái)源、體積、純度、完整性、后續(xù)分析所需的外泌體及可用的儀器和處理時(shí)間，目前常見(jiàn)的外泌體分離方法有離心法(如超速離心法、差速離心法、密度梯度離心法、蔗糖墊離心法)、超濾法(如凝膠滲透色譜法、尺寸排斥色譜法等[13])、沉淀法和免疫磁珠法等[14]。目前從培養(yǎng)的生殖細(xì)胞和女性生殖道體液中分離的外泌體常使用超速離心法進(jìn)行分離。有學(xué)者使用蔗糖墊離心法、超濾法和超速離心法分離外泌體，發(fā)現(xiàn)超速離心法可以得到足夠的蛋白組合轉(zhuǎn)錄組學(xué)材料以用于進(jìn)一步分析，明顯優(yōu)于蔗糖墊離心法及超濾法[15]。外泌體分離純化后進(jìn)行鑒定的常見(jiàn)方法為透射電子顯微鏡檢測(cè)、納米粒子示蹤分析、免疫印跡法、流式細(xì)胞術(shù)及高分辨率成像等[13]。在透射電子顯微鏡下可直接觀察外泌體的形態(tài)和直徑，是目前鑒定外泌體的金標(biāo)準(zhǔn)之一，但其無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量外泌體濃度，不適合快速大量檢測(cè)外泌體。免疫印跡法可鑒定多數(shù)外泌體常見(jiàn)蛋白質(zhì)，如CD63、CD9、CD81、熱休克蛋白等跨膜細(xì)胞蛋白[16-17]。

2 女性生殖道外泌體的類(lèi)型

女性生殖道外泌體根據(jù)形成部位和生物機(jī)制，主要分為輸卵管小體、子宮小體和陰道小體。

2.1輸卵管小體 輸卵管小體于2013年由Al-Dossary等[18]在小鼠輸卵管液中首次發(fā)現(xiàn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，輸卵管小體是輸卵管液的主要成分，并且是與配子-胚胎母體相互作用的潛在介質(zhì)[19]。輸卵管小體包含一系列生物活性分子，如蛋白質(zhì)、mRNA、lncRNA、脂質(zhì)及基因組DNA，可以通過(guò)活性分子反映細(xì)胞生理及病理狀態(tài)[20]。目前已在不同物種的輸卵管液中分離出輸卵管小體(小鼠[18]、牛[21]、人類(lèi)[22]、狗[23]等)，并且對(duì)狗、鼠、牛3種輸卵管小體的miRNA進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)2種共有的miRNA，即miR-30b和miR-375[24]，其中miR-375與氨基酸代謝、核苷酸代謝、糖代謝有關(guān)，并參與早期胚胎發(fā)育[23,25]。

2.2子宮小體 子宮小體于2008年由Griffiths等[26]首次在發(fā)情的小鼠子宮腔液中發(fā)現(xiàn)，已有學(xué)者證明子宮小體是由子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌[27]，其內(nèi)部所包含的蛋白質(zhì)是以周期性方式接受女性雌激素與孕激素的調(diào)節(jié)[28]。Greening等[29]研究表明，來(lái)自人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的高度純化的子宮小體蛋白組受類(lèi)固醇激素調(diào)節(jié)，當(dāng)雌激素主要作用時(shí)，子宮小體的蛋白質(zhì)組富含與細(xì)胞膜骨架重組和信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，并參與子宮內(nèi)膜修復(fù)。有研究表明，RNA、miRNA在子宮細(xì)胞外囊泡中選擇性包裝[30]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)214個(gè)miRNA是子宮小體及其起源細(xì)胞所共有的，其中13個(gè)特異性miRNA選擇性地包裝在子宮小體中，并且參與了胚胎植入的重要途徑，如細(xì)胞重塑、增殖及血管生成。有研究發(fā)現(xiàn)，子宮小體被人類(lèi)HTR-8滋養(yǎng)層細(xì)胞轉(zhuǎn)移內(nèi)化，增強(qiáng)了黏附功能，部分通過(guò)激酶信號(hào)傳導(dǎo)[29]，并檢測(cè)到hsa-miR-30d，發(fā)現(xiàn)使用miR-30d處理小鼠胚胎可顯著增加胚胎黏附性[31]。

2.3陰道小體 陰道小體于2018年首次于成熟發(fā)情小鼠陰道分泌液中發(fā)現(xiàn)[32]，其攜帶特征性生物標(biāo)志物(CD9、CD81和HSC70)及精子調(diào)節(jié)蛋白(PMCAs和酪氨酸磷酸化蛋白)，其中精子調(diào)節(jié)蛋白對(duì)精子成熟與獲能具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，女性陰道分泌液中的陰道小體對(duì)人類(lèi)免疫缺陷病毒-1早期的生命周期具有抑制作用，可以使女性免受人類(lèi)免疫缺陷病毒-1感染[33]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，壓力性尿失禁女性患者的陰道壁成纖維細(xì)胞所分泌的陰道小體具有抑制新生血管生成的作用，推測(cè)其可能在壓力性尿失禁的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[34]。

3 女性生殖道外泌體與精子成熟之間的相關(guān)作用

精子混合著精液在離開(kāi)男性生殖道進(jìn)入女性生殖道時(shí)，其與陰道、子宮內(nèi)膜和輸卵管環(huán)境相互作用，最終實(shí)現(xiàn)成功受精，但期間精子必須經(jīng)歷獲能，即精子頭膜經(jīng)歷一系列生化修飾，使精子到達(dá)卵母細(xì)胞的透明帶時(shí)能夠進(jìn)行頂體反應(yīng)，導(dǎo)致酶釋放，允許精子穿透透明帶與細(xì)胞質(zhì)膜融合，而女性生殖道外泌體對(duì)精子功能連續(xù)編程起著重要作用[35]。

在精子進(jìn)入女性生殖道后，大部分精子滯留于陰道，形成陰道栓。陰道黏膜分泌的外泌體可與精子相互作用，其中陰道小體可使精子細(xì)胞膜的PMCA4a與蛋白精子黏附分子-1顯著增加，共同使精子進(jìn)一步成熟、獲能，增加受精能力[32]。PMCA4a是精子膜上主要的Ca2+外排泵，調(diào)節(jié)精子的Ca2+動(dòng)態(tài)平衡。有研究表明，PMCA4a基因缺失可導(dǎo)致精子的進(jìn)行性和過(guò)度活躍的運(yùn)動(dòng)性喪失，致雄性不育[36]。蛋白精子黏附分子-1是一種透明質(zhì)酸酶，促使精子穿透卵丘基質(zhì)和卵泡周?chē)臻g。子宮小體及輸卵管小體在精子成熟與獲能方面也起著重要作用，可以改變精子表面膜成分和新陳代謝，且均攜帶大量PMCA4a。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠輸卵管小體PMCA4a形式比子宮小體的PMCA4a更有優(yōu)勢(shì)，并且與其他周期相比，在發(fā)情前期、發(fā)情期PMCA4a高度表達(dá)，輸卵管小體通過(guò)整合素αvβ3和α5β介導(dǎo)與精子膜融合并將PMCA4a傳遞給精子，同時(shí)PMCA4a可以防止精子過(guò)早獲能和支持精子受精潛力[32]。

4 女性生殖道外泌體與胚胎之間的相互作用

子宮小體在孕期滋養(yǎng)層細(xì)胞的產(chǎn)生中起著重要作用。Greening等[29]研究發(fā)現(xiàn)，人體子宮內(nèi)膜來(lái)源的ECC1細(xì)胞系分泌的外泌體可被HTR-8滋養(yǎng)層細(xì)胞所攝取并增強(qiáng)黏附功能，并且與子宮小體共同培養(yǎng)1.5 h后，HTR-8滋養(yǎng)層細(xì)胞出現(xiàn)最大的黏附改變并維持4 h，更重要的是，與僅用雌激素處理的細(xì)胞(增殖期)相比，當(dāng)親本細(xì)胞用雌激素與孕激素處理以模擬接受性子宮內(nèi)膜時(shí)，黏附率明顯高于單獨(dú)雌激素處理的細(xì)胞，且黏附刺激與子宮小體黏附分子含量的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)是一致的，其中纖維連接蛋白在HTR-8滋養(yǎng)層細(xì)胞中隨著外泌體攝取而增加。此外，黏著斑激酶(FAK)途徑各因子水平顯著增加，表現(xiàn)為總FAK和磷酸化FAK蛋白的高水平表達(dá)，表明該途徑可能參與了子宮小體攝取后HTR-8滋養(yǎng)層細(xì)胞黏附功能的增加[30]，并且FAK亦是胚胎囊泡、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞之間的細(xì)胞外囊泡通訊通路之一[28]。Ng等[30]認(rèn)為，在精子植入前期，細(xì)胞外微環(huán)境內(nèi)的部分子宮小體可以通過(guò)FAK信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞黏附性。有研究報(bào)道，通過(guò)體外培養(yǎng)胚胎與牛輸卵管小體時(shí)發(fā)現(xiàn)，胚泡可以主動(dòng)攝取輸卵管小體，并且在攝取之后明顯改善胚泡質(zhì)量，延長(zhǎng)胚泡存活期，提高體外存活率和細(xì)胞、胚胎數(shù)量[21]。Lopera-Vasquez等[37]發(fā)現(xiàn)輸卵管小體通過(guò)下調(diào)IFN-τ和PLAC8(與胚胎植入相關(guān)的基因)來(lái)改變胚胎的基因表達(dá)，從而改善胚胎發(fā)育和質(zhì)量，并且該表達(dá)模式與體內(nèi)胚胎類(lèi)似。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，小鼠輸卵管小體可以改變體外培養(yǎng)胚胎細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖相關(guān)基因(BAX、BCL-2、OCT-4)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞分化，從而改善胚胎存活率[38]。

外泌體中含有多種金屬蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶-14、金屬蛋白酶-10。國(guó)外學(xué)者研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶-14、金屬蛋白酶-10可以調(diào)節(jié)子宮小體不同因子的活性和生物利用度，進(jìn)而影響胚胎和子宮內(nèi)膜之間的相互作用[30,39]。有研究顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶-14、金屬蛋白酶-10對(duì)促進(jìn)胚胎植入和早孕有著重要的作用[28]。有研究報(bào)道，輸卵管小體可以通過(guò)提高精子獲能和受精能力，從而改善胚胎發(fā)育及低溫抗性[18,22]，提高胚胎移植率和出生率[38]。有學(xué)者通過(guò)牛輸卵管小體質(zhì)譜分析鑒定了336個(gè)蛋白質(zhì)簇，發(fā)現(xiàn)多種蛋白對(duì)受精及早期胚胎發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[24]，并且在排卵后期有助于精子從精子庫(kù)中釋放，并使精子過(guò)度活化、運(yùn)輸，以滿足卵母細(xì)胞受精和早期胚胎發(fā)育[24,40]。

5 展望

女性生殖道外泌體作為精子與女性生殖道及胚胎與母體之間的直接和間接的交流方式，通過(guò)介導(dǎo)一系列外泌體的分子機(jī)制來(lái)研發(fā)女性生殖道新的調(diào)節(jié)劑，并通過(guò)對(duì)外泌體內(nèi)部miRNA的進(jìn)一步探索，有助于實(shí)現(xiàn)新的納米治療與納米診斷，使得外泌體在女性生殖能力方面具有一定的診斷和治療潛力。