李 鉑，唐志書(shū)*，許洪波，黃文靜，王 楠，孫曉春，解江冰，劉玉蘭，陸 博

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西咸陽(yáng) 712083；2.陜西云嶺生態(tài)科技有限公司，陜西西安 710000；3.柞水縣科技開(kāi)發(fā)中心，陜西柞水 711400）

五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.為木蘭科五味子屬多年生木質(zhì)藤本,其干燥果實(shí)又稱(chēng)北五味子［1］,為傳統(tǒng)大宗藥材之一,具有澀精止瀉、生津斂汗等功效。北五味子主產(chǎn)東北三省、內(nèi)蒙古、河北等地［2］,果實(shí)富含五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素等木脂素類(lèi)［3-4］、有機(jī)酸、揮發(fā)油、多糖等多種化合物［5-6］。秦嶺地區(qū)氣候環(huán)境適宜、植被類(lèi)型豐富,分布有華中五味子S.sphenanthera、紅花五味子S.rubriflora、鐵箍散S.propinquavar. sinensis等多種五味子屬植物［7］。北五味子作為傳統(tǒng)中藥和保健食品的原料,隨著市場(chǎng)需求不斷增加,人工種植的北五味子面積逐漸增大,研究采收期對(duì)五味子藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的影響具有重要的指導(dǎo)意義。本研究對(duì)處于不同成熟期的北五味子進(jìn)行分批采收,測(cè)定果實(shí)中總酚酸、總黃酮、總多糖、木脂素類(lèi)等成分含有量,綜合多項(xiàng)指標(biāo),確定移栽于秦嶺地區(qū)北五味子的最佳采收時(shí)期,以期為五味子藥材規(guī)范化種植提供一定的技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料

美國(guó)Waters ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器公司）。沒(méi)食子酸（批號(hào)731C031）、福林酚購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蘆?。ㄅ?hào)170221）、葡萄糖（批號(hào)160509）、五味子醇甲（批號(hào)160513）、五味子乙素（批號(hào)160521）購(gòu)自陜西樂(lè)博生化有限公司；乙腈（色譜純,美國(guó)Honeywell公司）；磷酸（色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水,其余試藥均為國(guó)產(chǎn)分析純。

北五味子種植于陜西省商洛市柞水縣北河村陜西云嶺生態(tài)科技有限公司五味子科技示范基地內(nèi)（33°49′52.8″ N,109°12′42.7″ E,海拔1 434 m）,經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤教授鑒定為木蘭科五味子屬五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品采集與前處理 分別于2017年8月15日、8月30日、9月15日采收3批五味子樣品,每批隨機(jī)設(shè)3個(gè)重復(fù),樣品收集后洗凈,50 ℃烘干。取3批已干燥的樣品,粉碎并過(guò)3號(hào)篩,每個(gè)樣品稱(chēng)0.5 g,精密稱(chēng)定,置于具塞錐形瓶中,加入25 mL 70%乙醇,超聲提取30 min,取出放冷,補(bǔ)足減失質(zhì)量,過(guò)濾即得。

2.2 五味子總酚酸含有量測(cè)定 采用福林酚法測(cè)定五味子中總酚酸含有量［8］。精密量取0.425 mg/mL沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0、15、30、45、60、75、90 μL,蒸餾水補(bǔ)體積至100 μL,加入福林酚試劑1.5 mL,搖勻；加入7.5%Na2CO3溶液1.5 mL,30 ℃避光反應(yīng)1.5 h,測(cè)定765 nm處吸光度,以沒(méi)食子酸含有量為橫坐標(biāo)（X）,以吸光值為縱坐標(biāo)（Y）,得回歸方程為Y=0.021 3X+0.057 2 （r=0.997 5）。分別吸取“2.1” 項(xiàng)下待測(cè)樣品100 μL,按上述測(cè)定方法,記錄765 nm處吸光值,計(jì)算總酚酸含有量。結(jié)果表明,五味子果實(shí)中總酚酸含有量隨采收時(shí)間的變化呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),采收于8月30日的果實(shí)中總酚酸含有量最高為15.749 mg/g,見(jiàn)表1。

2.3 五味子總黃酮含有量測(cè)定 總黃酮含有量測(cè)定采用NaNO2-Al （NO3）3比色法［9］。精密量取1 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液0、20、40、60、80、100、120 μL,70% 乙醇補(bǔ)體積至200 μL,依次加入30% 乙醇1.8 mL、5% NaNO20.5 mL,搖勻,靜置6 min；加入10% Al （NO3）30.5 mL,搖勻,靜置6 min；最終加入1 mol/L NaOH 2 mL,搖勻,靜置15 min,測(cè)定510 nm處吸光值。以蘆丁含有量為橫坐標(biāo)（X）,以吸光值為縱坐標(biāo)（Y）,得回歸方程為Y=0.002 3X+0.009 3 （r=0.996 1）。分別吸取“2.1” 項(xiàng)下待測(cè)樣品200 μL,按相同方法測(cè)定,記錄510 nm處吸光值,計(jì)算總黃酮含有量。結(jié)果表明,五味子果實(shí)中總黃酮含有量隨采收時(shí)間的延長(zhǎng)亦表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì),采收于8月30日的果實(shí)中總黃酮含有量最高為8.543 mg/g,見(jiàn)表1。

2.4 五味子多糖提取與含有量測(cè)定

2.4.1 五味子粗多糖制備 稱(chēng)取五味子樣品0.250 g,置于具塞錐形瓶中,加入蒸餾水10 mL,超聲20 min,濾過(guò),重復(fù)上述提取步驟。取2次水提液,合并,加入無(wú)水乙醇,使其終濃度達(dá)到80%。4 ℃靜置24 h,10 000 r/min條件下離心5 min,棄去上清,50 ℃烘干至恒定質(zhì)量,得五味子粗多糖粉末。向粉末中加入25 mL蒸餾水,溶解,待用。

2.4.2 五味子多糖含有量測(cè)定 五味子多糖含有量采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)定［10］。精密量取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、50、100、150、200、250、300 μL,蒸餾水補(bǔ)足體積,依次加入5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL,搖勻,靜置10 min,40 ℃水浴15 min；取出后迅速冰浴,10 min后測(cè)定490 nm處吸光值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X）,以490 nm處吸光值為縱坐標(biāo)（Y）,得回歸方程為Y=0.013 8X+0.077 9 （r=0.996 0）。分別吸取“2.4.1” 項(xiàng)下待測(cè)樣品300 μL,按上述方法測(cè)定490 nm處吸光值,計(jì)算多糖含有量。結(jié)果表明,五味子果實(shí)中多糖含有量隨著五味子果實(shí)成熟度的增加逐漸降低,9月15日采收的果實(shí)相比8月30日采收的樣品中多糖含有量下降60.92%,見(jiàn)表1。

表1 不同采收期五味子果實(shí)中3種指標(biāo)含有量比較（，mg/g）

表1 不同采收期五味子果實(shí)中3種指標(biāo)含有量比較（，mg/g）

2.5 2種木脂素含有量測(cè)定

2.5.1 樣品處理及制備 精密稱(chēng)定不同采收時(shí)間五味子粉末約0.3 g,置于具塞錐形瓶中,加入甲醇25 mL,稱(chēng)定質(zhì)量；超聲提取20 min,取出放冷,再次稱(chēng)定質(zhì)量,以甲醇補(bǔ)足失質(zhì)量；搖勻?yàn)V過(guò),取續(xù)濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜,用于UPLC分析。

2.5.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)定五味子醇甲和五味子乙素對(duì)照品各5.0 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,制備成0.5 mg/mL的對(duì)照品貯備液。

2.5.3 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm,1.7 μm）；流動(dòng)相0.1%磷酸（A）-乙腈（B）,梯度洗脫（0～10 min,90% A,10% B；10～13 min,100% B；13～15 min,90% A,10% B）；體積流量0.2 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量2 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 各成分UPLC色譜圖

分別精密吸取稀釋至適宜濃度的對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5 μL,注入超高效液相色譜儀,在“2.5.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,每個(gè)體積進(jìn)樣3次,記錄各對(duì)照品的峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）,以對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X）,進(jìn)行回歸,結(jié)果見(jiàn)表2。表明各成分在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表2 各成分線(xiàn)性關(guān)系

2.5.4 精密度試驗(yàn) 取同一批次樣品粉末（9月15日采收）,按“2.5.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.5.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,每次2 μL,記錄峰面積,測(cè)得五味子醇甲和五味子乙素峰面積的RSD分別為1.16%、1.28%,表明儀器精密度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（9月15日采收）,在 “2.5.3” 項(xiàng)條件下,分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h進(jìn)樣2 μL,記錄峰面積,測(cè)得五味子醇甲和五味子乙素峰面積的RSD分別為0.87%、1.55%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱(chēng)取同一批次樣品粉末6份（9月15日采收）,按“2.5.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.5.3” 項(xiàng)條件下分別進(jìn)樣2 μL,記錄峰面積,五味子醇甲和五味子乙素含有量的RSD分別為2.08%、1.99%,表明該方法重復(fù)性較好。

2.5.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取6份含有量已知的9月15日樣品粉末約0.15 g,根據(jù)樣品中五味子醇甲、五味子乙素含有量的80%、100%、120%,分別精密加入對(duì)照品溶液,按 “2.5.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.5.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,計(jì)算加樣回收率,五味子醇甲和五味子乙素平均加樣回收率分別為102.86%、100.07%,RSD分別為2.28%、2.03%。

2.5.8 樣品含有量測(cè)定 精密吸取“2.5.1” 項(xiàng)下樣品溶液各2 μL,注入超高效液相色譜儀,在“2.5.3” 項(xiàng)條件下測(cè)定2種木脂素的含有量。結(jié)果表明,五味子醇甲和五味子乙素含有量隨采收時(shí)間的變化呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),8月30日前后含有量最高,分別達(dá)到5.540、3.020 mg/g,見(jiàn)表3。

表3 不同采收期樣品中2種木脂素含有量比較（，mg/g）

表3 不同采收期樣品中2種木脂素含有量比較（，mg/g）

3 討論

本研究通過(guò)觀測(cè)北五味子移栽于秦嶺地區(qū)之后,不同成熟期果實(shí)中總酚酸、總黃酮、多糖及木脂素含有量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)采收時(shí)間對(duì)五味子藥材品質(zhì)相關(guān)的多個(gè)指標(biāo)影響顯著?？傸S酮、總酚酸以8月30日前后采收的樣品中含有量最高,多糖含有量隨著采收期的延遲逐漸降低。

研究表明,五味子莖藤、葉和果實(shí)中均含較多酚酸和黃酮類(lèi)成分［11-12］,這兩類(lèi)成分在不同部位的積累規(guī)律為葉＞莖藤＞果實(shí)［13］。同時(shí),五味子果實(shí)含有豐富的總多糖,具有較強(qiáng)的抗氧化能力［14］。郭志欣等［15］通過(guò)對(duì)通化市不同采收期栽培五味子多糖含有量進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)8月下旬栽培北五味子中多糖含有量最高,隨著采收期的延后含有量逐漸下降。潘丕克等［16］發(fā)現(xiàn)遼寧地區(qū)北五味子種子與果肉中,五味子醇甲和五味子乙素的含有量在采收期呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),在9月上旬達(dá)到最高值。本研究中,8月30日采收的五味子果實(shí)中五味子醇甲和五味子乙素含有量最高,不同采收時(shí)間五味子醇甲的含有量均高于2015年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定的最低含有量（0.40%）［1］,表明不同引種栽培地區(qū)的氣候條件和環(huán)境因子可能會(huì)影響五味子的最適采收期。

綜合多種指標(biāo),并結(jié)合當(dāng)?shù)貧夂驐l件,初步確定移栽于秦嶺地區(qū)的北五味子最佳采收時(shí)間在8月30日前后,此時(shí)五味子藥材的品質(zhì)為最佳。后續(xù)將對(duì)不同引種地區(qū)、不同生長(zhǎng)期北五味子生理生化特性、木脂素生物合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)水平等開(kāi)展更深入的研究,構(gòu)建移栽于秦嶺地區(qū)北五味子的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)模型和有效成分動(dòng)態(tài)積累模型,以期全面評(píng)價(jià)北五味子的品質(zhì)形成規(guī)律,更好地為五味子規(guī)范化種植和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支持。