楊鵬飛 楊成宇林 玲胡建慧周 瑩孫小祥夏國華楊 歡*

（1.常州市金壇區(qū)人民醫(yī)院，江蘇常州 214000；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3.鎮(zhèn)江市中醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212003）

僵蛹為蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx moriL.的蛹接種白僵菌Beauveria bassiana發(fā)酵后的制品,常作為僵蠶的代用品,可用于治療高熱驚厥、癲癇、上呼吸道感染、流行性腮腺炎等,還具有抗凝、抗癌和其他藥理作用［1］。

僵蠶（蛹）的應(yīng)用廣泛,需求量大,市面上出現(xiàn)了一些偽品,如感染綠僵菌Metarhizium anisopliae致死的家蠶和黑死蠶等［2］,對臨床用藥的安全性和有效性造成了負(fù)面影響。目前以僵蛹入藥的臨床常用中成藥有天蠶膠囊和天蠶片,傳統(tǒng)的性狀與顯微鑒別方法無法實現(xiàn)其中僵蛹成分的準(zhǔn)確鑒定。DNA分子鑒定技術(shù)對不同物種具有高度特異性,比傳統(tǒng)鑒定方法更為可靠［3］,近年來在中藥鑒定領(lǐng)域備受關(guān)注。如DNA條形碼技術(shù),是利用DNA片段自身在物種種內(nèi)的特異性和種間的多樣性對物種進行鑒定［4-7］,結(jié)果準(zhǔn)確度高,但是產(chǎn)物需要測序,操作步驟繁瑣,尤其是不適用于混合物；而特異性引物擴增是根據(jù)基因序列存在的差異所設(shè)計的引物進行PCR,在樣品檢驗過程中無需測序,可同時測定多個物種,且適用于混合物,彌補了DNA條形碼技術(shù)的不足［8-9］。

本研究根據(jù)僵蛹中家蠶和白僵菌及其常見偽品綠僵菌的線粒體全基因（mtDNA）序列的差異設(shè)計引物,進而基于特異性引物擴增建立了具有較強專屬性且能夠簡便快速地檢測天蠶片和天蠶膠囊中僵蛹成分的技術(shù),以期為市面中成藥產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 恒溫混勻儀（拓普森科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16C型高速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SHZ型恒溫振蕩器（國華電器有限公司）；NanoDrop 1000型核酸蛋白分析儀 （美國Thermo公司）；T100型PCR儀、Basic型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；JY-SPFT型水平電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；GenoSens 1860型凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 白僵菌購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,保藏編號為CICC41021；綠僵菌購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院,保藏編號為BNCC 114445；家蠶對照藥材（B/N 121457-200501）購自中國食品藥品檢定研究院；中成藥天蠶片、天蠶膠囊購自藥房,具體信息見表1；蠶蛹由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。Tris平衡酚（北京索萊寶科技有限公司）；dNTP Mix、DreamTaq Green DNA Polymerase （美國Thermo公司）；Agarose-Low EEO （上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Ethidium Bromide （美國Sigma公司）；Low ladder SN127 （南京生興生物技術(shù)有限公司）為生物級；其他試劑均為分析純,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司和上海阿拉丁生化科技股份有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 自制僵蛹 參考文獻［10］,稱取蠶蛹粉10.0 g,加10 mL水混勻,121 ℃滅菌30 min,冷卻至室溫,作為發(fā)酵基質(zhì)。無菌環(huán)境下進行白僵菌液接種,（27±1）℃培養(yǎng),15 d后,待基質(zhì)內(nèi)外長滿菌絲體時取出,60 ℃干燥24 h,制得10批白僵蛹（BJ1～BJ10）。同法自制10批綠僵蛹（LJ1～LJ10）和10批不接菌種的空白蠶蛹（NJ1～NJ10）。

2.2 供試品溶液制備 稱取家蠶對照品、白僵菌、綠僵菌、自制僵蛹各20.0 mg,加入CTAB提取液1 000 μL,65 ℃孵育2 h后離心,上清液加入等體積70%甲醇,充分混勻,置于-20 ℃下冷凍1 h,離心,待甲醇揮干后,加入CTAB提取液500 μL,65 ℃孵育1 h,離心,上清液加入等體積的三氯甲烷/Tris-飽和酚（1 ∶1）,混勻,離心,加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1）,混勻,離心,加入3 mol/L醋酸鉀溶液100 μL,再加入與上清液等體積的預(yù)冷異丙醇,混勻后置于-20 ℃下冷凍1 h,離心,沉淀中加入預(yù)冷的70%乙醇500 μL洗滌后,室溫晾干,以TE緩沖液25 μL溶解,得到DNA供試品溶液,4 ℃保存。

2.3 特異性引物設(shè)計 從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索下載家蠶、白僵菌及其常見偽品綠僵菌的線粒體全基因組序列,并采用DNAMAN軟件比對3個物種的基因差異,利用Oligo 7軟件設(shè)計特異性引物,并通過NCBI Primer-BLAST評估,特異性引物的序列等信息如表2所示。

表2 特異性引物

2.4 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系由以下成分組成［11］：1×擴增緩沖液,200 μmol/L dNTPs,引物對1.0 μL （正向與反向各半）,1 μL模板DNA （10 ng）,Taq DNA聚合酶0.625 U,200 μmol/L MgCl2,再加入無菌雙蒸水至25 μL。反應(yīng)結(jié)束后將擴增產(chǎn)物載入2%TBE瓊脂糖凝膠進行分離,紫外下觀察目的片段條帶。研究中還優(yōu)化了退火溫度、引物濃度以及循環(huán)數(shù)等,最終建立了PCR擴增條件,見表3。

表3 PCR擴增條件

2.5 特異性及靈敏度 將不同批3種自制樣品在“2.4”項條件下與3種特異性引物（PM、PB、PA）進行擴增以驗證特異性。圖1顯示,家蠶、白僵菌的DNA經(jīng)擴增后分別在61、94 bp處產(chǎn)生條帶,而綠僵菌的DNA經(jīng)擴增后,在144 bp處產(chǎn)生條帶；各引物之間無交叉反應(yīng),體現(xiàn)出了很強的專屬性。

保持引物PM、PB、PA的濃度均為0.2 μmol/L,分別加入0.01、0.1、1、10 ng/μL DNA模板各1 μL,進行PCR以考察靈敏度。從圖2中可以看出,在以特異性引物PM或PA擴增時,如DNA模板質(zhì)量濃度分別為1、10 ng/μL,可檢出目的片段條帶；引物PB在模板質(zhì)量濃度分別為10、1、0.1 ng/μL時均能檢出條帶,故對家蠶和綠僵菌的檢出限為1 ng,而對白僵菌的檢出限為0.1 ng。

圖2 靈敏度檢測電泳圖

2.6 自制僵蛹檢測 以特異性引物PM、PB和PA對20批自制僵蛹和10批空白蠶蛹進行PCR擴增,以考察該技術(shù)的準(zhǔn)確性。從圖3可以看出,10批白僵蛹及其常見偽品綠僵蛹的DNA經(jīng)擴增后,產(chǎn)生的條帶位置與預(yù)期目的片段的長度一致。

圖3 自制僵蛹的檢測電泳圖

2.7 天蠶片和天蠶膠囊檢測 通過本研究所建立的技術(shù)對3批天蠶片以及3批天蠶膠囊中的僵蛹成分進行檢測,驗證標(biāo)簽所示物種是否準(zhǔn)確。分別精密稱取6批中成藥樣品粉末20.00 mg,按“2.2” 項下方法提取與純化DNA,然后在“2.4” 項條件下擴增。由圖4、表4可見,這6批市售中成藥經(jīng)均檢出了僵蛹的基原家蠶和白僵菌,并且未檢測出綠僵菌。

圖4 天蠶膠囊及天蠶片的檢測電泳圖

表4 天蠶片和天蠶膠囊鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

研究表明生命體中mtDNA較為豐富,比細胞核DNA等其他遺傳標(biāo)記更適合物種鑒定；同時,多拷貝mtDNA在加工產(chǎn)物中比單拷貝核DNA有更高的存活機會,有助于提高分析靈敏度［12-14］。本研究基于mtDNA種間差異設(shè)計的特異性引物能同時檢出家蠶、白僵菌及其常見偽品基原綠僵菌,且引物間無交叉反應(yīng),體現(xiàn)出很強的專屬性。

研究表明蛹相比幼蟲和成蟲的微生物豐富度更高［15］,因此開展蛹的質(zhì)量控制技術(shù)研究具有一定意義。本研究利用特異性擴增技術(shù)鑒定了天蠶片和天蠶膠囊中的僵蛹成分,該技術(shù)準(zhǔn)確可靠,且方便快速,有助于監(jiān)控含僵蠶（蛹）中成藥的質(zhì)量。

本研究考慮到僵蛹與僵蠶的基原一致,而天蠶片和天蠶膠囊僅含有僵蛹,是成分最為簡單的臨床常用中成藥,因而被選擇作為研究對象,而沒有選擇其他較為復(fù)雜的含有僵蠶成分的成方制劑。在目前正在進行的工作中,課題組已經(jīng)選擇了含有僵蠶的中成藥金嗓清音丸和中風(fēng)回春丸作為研究對象,這2種中成藥的成分復(fù)雜,開展專屬性鑒定研究更具意義。

中成藥中同時含有多種動物藥成分,由于制法復(fù)雜、輔料干擾,其鑒定難度很大,在后續(xù)的工作中將進一步開展相關(guān)研究,優(yōu)化測定條件,建立專屬性鑒定技術(shù)以期從中成藥中同時鑒定多種動物藥成分。

本研究的鑒定依據(jù)為DNA分子,因而無法實現(xiàn)僵蠶和僵蛹區(qū)別,也無法用于鑒別添加染了白僵菌的蠶沙等制偽現(xiàn)象,在后續(xù)工作中考慮結(jié)合使用差異性蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)或者采用DNA定量擴增技術(shù)開展進一步研究。