劉滕飛，林 濤，任利輝，李廣平，彭建軍

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 100034)

在我國，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱冠心病)的發(fā)病率及死亡率逐年升高，已成為影響人類健康的最重要疾病之一。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)，目前認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化是一種以具有免疫活性的單核細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的動(dòng)脈壁的慢性炎性疾病[1-2]。單核細(xì)胞的募集是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，單核細(xì)胞可黏附于血管內(nèi)膜向內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)下間隙遷移，分化成為巨噬細(xì)胞進(jìn)而吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫細(xì)胞[2-3]。近年的研究結(jié)果提示，單核細(xì)胞的募集由趨化因子及其G蛋白偶聯(lián)受體調(diào)控[4]。血液循環(huán)和動(dòng)脈壁中趨化因子的上調(diào)在白細(xì)胞募集、早期動(dòng)脈炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化形成及斑塊不穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用[5-7]。因此，針對(duì)冠心病發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討，及早預(yù)防和及早干預(yù)是當(dāng)今基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的重中之重。

趨化素樣因子超家族成員5(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing member 5，CMTM5)是趨化素樣因子家族的第5個(gè)成員，該基因定位于14q11.2，位于白細(xì)胞介素25編碼基因下游，與其緊密連鎖。CMTM5由北京大學(xué)人類疾病基因研究中心在國際上首次報(bào)道，其編碼的產(chǎn)物具有潛在四次跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，且存在分泌蛋白形式，CMTM5由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，廣泛表達(dá)于正常成人和胎兒組織內(nèi)[8]。研究表明，CMTM5與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲等生物功能密切相關(guān)，是有潛在應(yīng)用價(jià)值的抑癌分子。Voora等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，CMTM5基因表達(dá)量的變化與心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)緊密相關(guān)。本課題組既往的研究結(jié)果表明，CMTM5基因與冠心病患者服用抗血小板藥物期間血小板高反應(yīng)性及支架術(shù)后患者心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[10]，但對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生發(fā)展及相關(guān)機(jī)制尚未進(jìn)行探討。

本研究通過測(cè)定人群中CMTM5水平，探討CMTM5與動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，同時(shí)觀察CMTM5表達(dá)量變化對(duì)THP-1向ECs黏附和遷移能力的影響。本研究通過在基因及細(xì)胞學(xué)水平闡明CMTM5在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，以期為抑制動(dòng)脈粥樣硬化、阻止冠心病的發(fā)生及防治研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

入選2015年1月至2017年12月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院心內(nèi)科接受住院治療并行冠狀動(dòng)脈造影檢查的患者共700例，其中男400例、女300例，平均年齡(58.1±7.6)歲。所有入選者均在我院接受冠狀動(dòng)脈造影檢查。冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)：冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)左前降支、左回旋支、右冠狀動(dòng)脈及主要分支中至少一支主要冠狀動(dòng)脈直徑狹窄達(dá)50%以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有肝、腎、甲狀腺、血液系統(tǒng)疾病及腫瘤的患者,或存在炎癥、感染或自身免疫系統(tǒng)疾病、1型糖尿病及家族性高脂血癥的患者。

1.2 血樣品采集、基因組RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)

空腹?fàn)顟B(tài)下抽取研究對(duì)象外周血5 mL，加入含EDTA的真空抗凝管中，室溫3 000 r/min離心20 min，分離血漿，多管分裝保存，于-80 ℃低溫冰箱保存，剩余血液置-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。分裝的部分血漿用于測(cè)定入選患者血漿中CMTM5水平。

采用Trizol法提取細(xì)胞RNA，采用紫外分光光度法對(duì)提取的總RNA濃度進(jìn)行測(cè)定，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為：25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 7 min，40 ℃ 10 min。行定量PCR反應(yīng)，溶解曲線為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。取5 μL的RT-PCR產(chǎn)物與1 μL的溴酚藍(lán)溶液混合，經(jīng)1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳鑒定，150 V電壓下電泳40 min，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)紫外光照射下進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血漿中CMTM5表達(dá)量

將患者的血漿樣本與樣本稀釋液以體積比為1 ∶5稀釋，用倍比稀釋的方法制備標(biāo)準(zhǔn)品，濃度梯度分別為300、200、100、50、25 μg/L。每孔加入50 μL血漿稀釋液，封板膜封板，37 ℃溫育30 min，洗板，棄去廢液，每孔加入300 μL洗板液，拍干，反復(fù)洗板5次，向各孔中加入酶標(biāo)試劑50 μL(空白孔除外)，溫育，洗滌方法同前，最后加入50 μL顯色劑A及顯色劑B，震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，每孔加入50 μL終止液，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色，空白孔為調(diào)零，酶標(biāo)儀450 nm處讀數(shù)。

1.4 ECs培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選及THP-1細(xì)胞培養(yǎng)

選取EA.hy926血管ECs系進(jìn)行研究，此細(xì)胞系為人臍靜脈ECs融合細(xì)胞，與原代臍靜脈ECs的生物學(xué)功能相似，該細(xì)胞系相對(duì)好培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為10%(體積分?jǐn)?shù))DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱，0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶37 ℃消化1 min，輕輕晃動(dòng)，待細(xì)胞皺縮變圓時(shí)，加入等體積的培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打混勻，1 ∶3比例進(jìn)行傳代。傳代與凍存同時(shí)進(jìn)行，凍存條件為10%(體積分?jǐn)?shù))二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液，放置于液氮中保存。

轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選：本研究所用的過表達(dá)CMTM5的腺病毒由山東維真生物科技有限公司包被，低表達(dá)CMTM5的慢病毒由北京普瑞金生物科技有限公司包被。在6孔板每孔中接種1×105ECs，當(dāng)細(xì)胞融合度接近70%時(shí)，12 h后轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒，24 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率在90%以上。根據(jù)病毒載體抗性，加入G418進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選，G418對(duì)ECs的最小致死濃度為350 μg/L，10 d左右挑出單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，Western blot驗(yàn)證結(jié)果。

THP-1細(xì)胞購買自美國ATCC公司，以0.5×106接種于含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，3 d后收集細(xì)胞培養(yǎng)液至15 mL離心管中，700 r/min離心5 min，棄去上清液，用吸管輕輕吹打制成均勻的細(xì)胞懸液，1 ∶3比例傳代接種于培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

將1×105ECs接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至2×105時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。收集THP-1細(xì)胞至15 mL離心管中，700 r/min離心5 min，加入2 mL含10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液，加入15 mL/L鈣黃綠素，37 ℃避光孵育30 min，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗THP-1細(xì)胞3次，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取2×105的THP-1細(xì)胞均勻鋪至已棄掉培養(yǎng)液的接種好ECs的6孔板中，37 ℃避光孵育2 h，吸去培養(yǎng)液，以PBS輕輕沖洗3遍，加入少量培養(yǎng)液，于熒光倒置顯微鏡(Olympus Ⅸ-70)進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

實(shí)驗(yàn)分為5組：第1組為正常ECs組(non-infected ECs，EN組)， 第2組為過表達(dá)CMTM5ECs組(CMTM5overexpression ECs，EO組)， 第3組為過表達(dá)CMTM5對(duì)照組(lenti-mock infected ECs，EO-MOCK組)， 第4組為低表達(dá)CMTM5ECs組(CMTM5suppression ECs，ES組)， 第5組為低表達(dá)CMTM5對(duì)照組(lenti-mock infected ECs，ES-MOCK組)。

是的，我曾在同一天里，撰寫兩篇不同的文章，一邊同情社會(huì)革命黨，一邊擁護(hù)黑幫分子。 而且我對(duì)這兩派都信服。 難道革命中就沒有百分之一的真理？難道黑幫的反革命中就沒有百分之一的真理？[4]160

1.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

計(jì)數(shù)5×104個(gè)ECs接種于Transwells下室中，培養(yǎng)液加至600 μL，當(dāng)ECs完全貼壁后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。取5×104個(gè)THP-1細(xì)胞接種于Transwells上室中，培養(yǎng)液加至200 μL，37 ℃培養(yǎng)12 h，取出上室，10%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液中固定30 min，棉簽輕輕擦拭上室內(nèi)側(cè)后行姬姆薩染色(Giemsa stain)：Transwells上室浸泡于姬姆薩A液與B液1 ∶1比例的混合液中15 min，取出Transwells上室，浸泡于姬姆薩A液與B液1 ∶3比例的混合液中5 min，PBS沖洗Transwells上室3次，置于顯微鏡下(Leica DM3000)進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)分組同細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，以χ2檢驗(yàn)計(jì)算結(jié)果。采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)黏附和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖表分析及繪圖。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本資料

本研究共入選700例患者，其中冠心病患者350例，對(duì)照組350例，所有入選研究對(duì)象的臨床基線資料見表1。兩組患者的性別、年齡、體重指數(shù)等一般資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，糖尿病、高血壓患病率在冠心病組和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)室檢查提示，吸煙因素、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 CAD組和對(duì)照組的臨床基線資料Table 1 Baseline characteristics of the patients in CAD group and control group

2.2 CMTM5 mRNA和血漿蛋白水平與冠心病的相關(guān)性分析

冠心病組患者CMTM5基因mRNA表達(dá)量是對(duì)照組表達(dá)量的3.45倍，明顯高于對(duì)照組(P<0.05，圖1A)。

血漿CMTM5蛋白水平在兩組間的比較與其mRNA表達(dá)量在兩組間的比較趨勢(shì)一致，冠心病組患者血漿CMTM5蛋白平均水平為(206.1±26.9) μg/L,明顯高于對(duì)照組的(125.3±15.2) μg/L(P<0.05，圖1B)。

2.3 影響冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

采用Logistic回歸分析兩組的年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙、高血壓、糖尿病及高脂血癥等冠心病易患因素，結(jié)果提示CMTM5基因、年齡、性別、吸煙、高體重指數(shù)、高血壓、糖尿病、高脂血癥與冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)(P<0.05，表2)。

表2 Logistic回歸分析冠心病的易感因素Table 2 Logistic regression analysis of coronary artery disease risk factors

2.4 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，過表達(dá)CMTM5基因ECs組(EO組)中THP-1細(xì)胞黏附數(shù)量明顯高于對(duì)照組(EO-MOCK組)、正常細(xì)胞組(EN組)和CMTM5低表達(dá)的ECs組(ES組)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，ES組THP-1細(xì)胞黏附數(shù)量明顯低于EO-MOCK組、EN組和EO組(P均<0.01)。以上結(jié)果提示，CMTM5基因過表達(dá)能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞向ECs黏附，相反CMTM5基因低表達(dá)抑制THP-1細(xì)胞向ECs黏附。

2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎(chǔ)，是動(dòng)脈壁的一種慢性全身性炎性疾病，這種慢性炎癥反應(yīng)學(xué)說已經(jīng)被多數(shù)學(xué)者的研究所證實(shí)。血管內(nèi)皮損傷、血小板黏附聚集、單核細(xì)胞募集至血管壁是動(dòng)脈粥樣硬化的早期特征。單核細(xì)胞分化成為巨噬細(xì)胞，吞噬膽固醇(主要是氧化低密度脂蛋白)后變成泡沫細(xì)胞，分泌活性氧、脂質(zhì)介質(zhì)和各種炎性細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致更多的單核細(xì)胞以及T細(xì)胞和B細(xì)胞進(jìn)入動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)域，這種慢性炎癥反應(yīng)持續(xù)存在導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不斷發(fā)展，最終突出于管腔的斑塊和破裂的不穩(wěn)定斑塊阻斷冠狀動(dòng)脈正常的血流，導(dǎo)致心絞痛、心肌梗死、中風(fēng)等心血管事件的發(fā)生。

近年來眾多研究表明，炎癥細(xì)胞向血管壁的募集依賴于趨化因子及其相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體。趨化因子是一類小分子量的細(xì)胞因子家族，通過募集血液中的各類炎癥細(xì)胞，例如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等進(jìn)入受損或感染組織，在炎癥、血管生成、艾滋病、腫瘤等多種病理生理過程中發(fā)揮著重要作用[11-15]。

冠心病是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用和調(diào)控的多因素疾病，Lundberg等[16]的研究結(jié)果提示，趨化因子CXCL16與冠狀動(dòng)脈病變程度相關(guān)，Singh等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，CX3CR1使冠心病早發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加1.53倍，Cai等[18]的研究結(jié)果提示，CCL19、CCL21與動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并參與平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。

CMTM5最早在腫瘤領(lǐng)域被發(fā)現(xiàn)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附和遷移等生物學(xué)行為，是一個(gè)具有潛在價(jià)值的腫瘤抑制基因，在心血管領(lǐng)域鮮有研究報(bào)道。本課題組既往的研究表明，CMTM5基因rs723840多態(tài)位點(diǎn)與冠心病密切相關(guān)，CMTM5與冠心病患者支架術(shù)后血小板高反應(yīng)性密切相關(guān)，與心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，CMTM5基因低表達(dá)促進(jìn)受損傷的人血管ECs的增殖和遷移，促進(jìn)受損傷的血管ECs完整性的修復(fù)[10,19]。本研究對(duì)CMTM5基因與冠心病的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析并探討相關(guān)機(jī)制，研究結(jié)果表明，冠心病患者CMTM5基因mRNA及血漿CMTM5蛋白水平明顯高于對(duì)照組，CMTM5基因過表達(dá)促進(jìn)THP-1細(xì)胞向ECs黏附和遷移，本結(jié)果同既往研究結(jié)果一致，均提示CMTM5基因過表達(dá)能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病的發(fā)生發(fā)展。CMTM5基因促進(jìn)THP-1黏附、遷移能力的機(jī)制可能為CMTM5與白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-25緊密連鎖，這兩個(gè)基因在功能上有一定的相關(guān)性，存在趨化作用，以及CMTM5編碼的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)更接近于四次跨膜蛋白超家族，與β3整合素形成復(fù)合物，調(diào)控整合素依賴的細(xì)胞移動(dòng)和黏附，因此調(diào)控細(xì)胞的增殖分化、黏附、遷移等多種生物學(xué)行為。本研究為CMTM5基因與冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性又增加了一項(xiàng)基礎(chǔ)研究證據(jù)。