王為 李學(xué)濤 孔亮 姜爽 羅一夫 王曉波

摘 要 目的：制備細(xì)胞穿膜肽PFV修飾紫杉醇（PTX）/青蒿琥酯（ART）共載靶向膠束，并考察其體外抗腫瘤活性。方法：按前期優(yōu)化的工藝，采用薄膜水化法制備PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束，并對其進(jìn)行表征。以空白膠束作為空白對照，采用磺基羅丹明B法評價(jià)PTX膠束、ART膠束、PTX/ART膠束以及PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對人胃癌BGC-823細(xì)胞的毒性;以香豆素作為熒光探針取代PTX，制成相應(yīng)的不同膠束，采用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡測定和觀察BGC-823細(xì)胞對各膠束的攝取情況和靶向性;并通過Transwell小室法考察PTX膠束、ART膠束、PTX/ART膠束以及PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對BGC-823細(xì)胞侵襲的影響。結(jié)果：PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束的平均粒徑為（51.30±3.95） nm，分散系數(shù)為0.19±0.01，Zeta電位為（0.21±0.02） mV，PTX、ART的包封率均高于90%，形態(tài)呈圓球形。空白膠束對BGC-823細(xì)胞無明顯毒性，PTX膠束、PTX/ART膠束以及PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對BGC-823細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別為（3.09±0.22）、（1.93±0.24）、（1.11±0.15） ? ? ? μmol/L;不同膠束在BGC-823細(xì)胞核中的分布數(shù)量排序依次為PFV修飾香豆素/ART膠束>香豆素/ART膠束>香豆素膠束>空白對照，抑制細(xì)胞侵襲作用的大小依次為PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束>PTX/ART膠束>ART膠束>PTX膠束>空白對照。結(jié)論：制備的PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束符合《中國藥典》要求;其對BGC-823細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可提高藥物的靶向性和細(xì)胞對藥物的攝取能力，并能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞 細(xì)胞穿膜肽;紫杉醇;青蒿琥酯;膠束;人胃癌BGC-823細(xì)胞;靶向作用;抗腫瘤作用

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To prepare cell penetrating peptide PFV-modified paclitaxel （PTX）/artesunate （ART） co-loaded targeting micelles， and to investigate in vitro anti-tumor activity. METHODS： According to optimal technology， PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles were prepared by membrane hydration method， and were characterized. Using blank micelle as blank control， sulforhodamine B （SRB） method was used to evaluate the toxicity of PTX micelles， ART micelles， PTX/ART micelles and PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles to human gastric cancer BGC-823 cells. The coumarin was used as fluorescent probe replacing PTX to prepare corresponding micelles. Then，the uptake of BGC-823 cells to corresponding micelles and targeting effect were observed and determined by flow cytometry and fluorescence microscope. The effects of PTX micelles， ART micelles， PTX/ART micelles and PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles on the invasion of BGC-823 cells were investigated by Transwell chamber method. RESULTS： Average particle size of PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles was （51.30±3.95） nm; PDI was 0.19±0.01， and Zeta potential was （0.21±0.02） mV. The encapsulation efficiency of PTX and ART were higher than 90%. The shape of micelles were spherical. The blank micelles had no obvious toxicity to BGC-823 cells. The IC50 value of PTX micelles， PTX/ART micelles and PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles to BGC-823 cells were （3.09±0.22）， （1.93±0.24）， （1.11±0.15） μmol/L， respectively. The distribution amount of different micelles in BGC-823 cell nucleus in the descending order were PFV-modified coumarin/ART micelles>coumarin/ART micelles>coumarin micelles>blank control. The order of inhibitory effect was PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles>PTX/ART micelles>ART micelles>PTX micelles>blank control. CONCLUSIONS： Prepared PFV-modified PTX/ART co-loaded targeting micelles are in line with the quality of Chinese Pharmacopoeia. It shows strong cytotoxicity to BGC-823 cells， can improve the drug targeting and the cell uptake， and inhibit the invasion and metastasis of BGC-823 cells.

KEYWORDS ? Cell-penetrating peptide; Paclitaxel; Micelles; Artesunate; Human gastric cancer BGC-823 cells; Targeting effects; Anti-tumor effect

胃癌是消化道腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。目前，化療是胃癌的主要治療方式，但化療后殘余的癌細(xì)胞會通過侵襲作用導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移，且化療藥物會增加機(jī)體的毒副反應(yīng)，導(dǎo)致患者預(yù)后較差[2]。紫杉醇（PTX）具有較高抗癌活性，在臨床用于多種癌癥的治療，但溶解性低、生物利用度差、無選擇性分布是限制其臨床應(yīng)用的主要原因[3]。提高PTX的靶向性以降低其毒副作用并抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移顯得尤為重要。細(xì)胞穿膜肽（簡稱“PFV”）具有細(xì)胞穿透能力強(qiáng)的特點(diǎn)，并且能增加藥物在腫瘤部位的蓄積[4]。青蒿琥酯（ART）具有抑制腫瘤血管新生、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、增敏抗腫瘤化療藥物的作用[5-7]。膠束具有粒徑小和對機(jī)體毒性低等優(yōu)點(diǎn)，可增加化療藥物的溶解度并提高化療藥物對腫瘤的被動靶向性[8-11]。為提高PTX的腫瘤靶向性及其對腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用，本課題組前期優(yōu)化工藝后采用薄膜水化法制備了PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束，其中PFV用來提高細(xì)胞對藥物的攝取能力，PTX作為化療藥物，ART用來抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，對所制膠束進(jìn)行表征后并進(jìn)一步考察PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束的體外抗腫瘤作用，為膠束包載PTX的靶向給藥和ART抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)制劑開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

FA1004型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）;SG3300H型超聲波清洗機(jī)（上海冠特超聲儀器有限公司）;RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）;DZKW-S-4型恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械公司醫(yī)療器械五廠）;HBS-1096A型酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;JEM-1200EX型透射電鏡（日本Tokyo公司）;Accuri C型流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）;ZS90型激光散射粒徑測定儀（英國Malvern公司）;WJ-80B-Ⅱ型細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）;SW-CJ-1D型超凈臺（上海滬凈醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 藥品與試劑

PTX原料藥（批號：MB1178，純度：≥99%）、ART原料藥（批號：J0101A，純度：≥98%）、TPGS1000（批號：MB2036）、胰蛋白酶、磺基羅丹明B（SRB）、青鏈霉素雙抗均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）;Soluplus兩親性接枝共聚物（德國BASF公司）;二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-PFV（DSPE-PEG2000-PFV）修飾膠束的靶向材料由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑實(shí)驗(yàn)室合成;三氯甲烷、甲醇等試劑均為分析純，水為娃哈哈牌純凈水。

1.3 細(xì)胞

人胃癌BGC-823細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 膠束的制備

按照文獻(xiàn)方法[12]，精密稱取DSPE-PEG2000-PFV 1.5 mg、ART 2 mg、Soluplus 60 mg、TPGS1000 12 mg、PTX 0.5 mg于50 mL圓底燒瓶中，加5 mL三氯甲烷使溶解，然后在40 ℃水浴下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氯甲烷。待燒瓶底部形成一層均勻白色膜時(shí)，加入磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 7.4）5 mL，在35 ℃水浴下振搖11 min，再以微孔濾膜（0.22 μm）濾過2次，隨后將濾過的膠束溶液轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，以PBS定容至刻度，即得PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束。同時(shí)，按照上述方法制備空白膠束（空白對照）、PTX膠束、ART膠束和PTX/ART膠束，其中空白膠束只添加處方量的Soluplus和TPGS1000，PTX膠束只添加處方量的Soluplus、TPGS1000和PTX，ART膠束只添加處方量的Soluplus、TPGS1000和ART，PTX/ART膠束只添加處方量的Soluplus、TPGS1000、ART和PTX。

2.2 膠束的表征

按照本課題組前期建立的方法[12]測定膠束的包封率，采用激光散射粒徑測定儀和透射電鏡分別測定膠束的粒徑、多分散性指數(shù)（PDI）、Zeta電位并觀察其形態(tài)學(xué)特征，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯示，載藥膠束中PTX和ART的包封率均大于90%;5種膠束的粒徑在47～51 nm之間，其中PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束的粒徑分布具有良好的集中性且高度集中在51 nm左右;5種膠束的PDI均小于0.20，Zeta電位均呈電中性;外觀形態(tài)為圓球形。膠束的包封率、粒徑、PDI和Zeta 電位測定結(jié)果見表1;PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束的透射電鏡圖見圖1（其余膠束圖略）。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將BGC-823細(xì)胞接種到含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)（下同）。第2天換液，隔天傳代，采用4～6代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)。

2.4 膠束對BGC-823細(xì)胞的毒性作用考察

采用SRB法測定膠束的細(xì)胞毒性作用。按“2.1”項(xiàng)下方法分別制備空白膠束（空白對照）、PTX膠束、ART膠束、PTX/ART膠束和PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束，各含藥膠束中PTX濃度均為10 μmol/L，ART濃度均為100 μmol/L。采用二倍稀釋法，以PBS（pH=7.4）為稀釋溶劑，使各膠束的藥物濃度分別為處方濃度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64，作為系列稀釋倍數(shù)樣品進(jìn)行試驗(yàn)。將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種至96孔板中（1.5×104 ? ? ? 個(gè)/孔），分為不同稀釋倍數(shù)的膠束給藥組，先用不含藥的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，然后加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基[180 μL/孔，其中膠束給藥量均為20 μL/孔]，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后以10%三氯乙酸固定細(xì)胞，加入0.4%SRB染料染色22 min，再加入Tris堿液溶解混合后的染料染色25 min。最后，采用酶標(biāo)儀測定各孔在540 nm波長下的吸光度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率：[細(xì)胞存活率（%）=給藥組OD值/空白對照組OD值×100%]。試驗(yàn)重復(fù)3次。采用GraphPad 6.0軟件計(jì)算不同膠束對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果顯示，空白膠束對細(xì)胞無明顯毒性作用，PTX膠束、PTX/ART膠束和PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對細(xì)胞的IC50分別為（3.09±0.22）、（1.93±0.24）、（1.11±0.15） μmol/L（均以PTX計(jì)，下同），且PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對細(xì)胞的IC50顯著低于PTX膠束和PTX/ART膠束（P<0.05）。當(dāng)膠束濃度為處方濃度的1/16～1（即PTX濃度為0.63～10 μmol/L）時(shí)，PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束組細(xì)胞的存活率較其他各組均顯著降低（P<0.05）;當(dāng)膠束中PTX濃度為10 μmol/L時(shí)，對細(xì)胞的毒性作用最強(qiáng)，因此在后續(xù)試驗(yàn)中均設(shè)定膠束中PTX的濃度為10 μmol/L。結(jié)果見圖2。

2.5 BGC-823細(xì)胞對膠束的攝取情況考察

以香豆素作為熒光探針考察細(xì)胞對膠束的攝取情況。以香豆素代替PTX，按“2.1”項(xiàng)下方法制備香豆素膠束、香豆素/ART膠束、PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束（香豆素的含量均為2 μmol/L[3]，其余藥物和輔料的用量不變），并同時(shí)制備空白膠束作為空白對照。取對數(shù)生長期BGC-823細(xì)胞接種至6孔板中（2.5×105個(gè)/孔），分為不同膠束給藥組，先用不含藥的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，然后加入新鮮含藥培養(yǎng)基[180 μL/孔，其中膠束給藥量均為20 μL/孔（含藥膠束中ART濃度均為100 μmol/L）]，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。然后以PBS洗板，以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后加入0.5 mL PBS。采用流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度，該值越大，說明細(xì)胞對膠束的攝取越多。

結(jié)果顯示，空白對照組、香豆素膠束組、香豆素/ART膠束組、PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分別為（2.18±0.09）×104、（2.49±0.24）×106、（2.64±0.09）×106、（3.42±0.31）×106;其中，PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束的熒光強(qiáng)度最大，且顯著大于其他各膠束樣品（P<0.05），表明PFV修飾后可提高藥物的靶向性，結(jié)果見圖3。

2.6 膠束對BGC-823細(xì)胞的靶向性考察

以香豆素作為熒光探針考察膠束的靶向性。以香豆素代替PTX，按“2.1”項(xiàng)下方法制備香豆素膠束、香豆素/ART膠束、PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束;同法進(jìn)行細(xì)胞分組、給藥，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，以PBS洗板，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞8 min，在避光處用Hoechst 33258對細(xì)胞進(jìn)行染色。采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中藥物的分布情況，其中藍(lán)色熒光區(qū)域代表BGC-823細(xì)胞核，綠色熒光區(qū)域代表香豆素，藍(lán)綠色熒光區(qū)域?yàn)榧?xì)胞與香豆素分布的疊加處。

結(jié)果顯示，在各膠束樣品中，PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束在細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度最大，說明藥物可選擇性地分布在細(xì)胞核內(nèi)。各組細(xì)胞中熒光強(qiáng)度的大小順序?yàn)镻FV修飾香豆素/ART共載靶向膠束組>香豆素/ART膠束組>香豆素膠束組>空白對照組，結(jié)果見圖4。

2.7 PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束對BGC-823細(xì)胞侵襲的影響

采用Transwell小室法進(jìn)行測定。按“2.1”項(xiàng)下方法分別制備空白膠束（空白對照）、PTX膠束、ART膠束、PTX/ART膠束和PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束，各含藥膠束中PTX濃度均為10 μmol/L，ART濃度均為100 μmol/L。取對數(shù)生長期BGC-823細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶溶液消化后，接種在Transwell小室中（1.5×105 ? 個(gè)/孔），分為不同膠束給藥組，各小室中加入相應(yīng)含藥培養(yǎng)基[200 μL/室，給藥量為20 μL/室]。在24孔板中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基（700 μL/孔），將上述Transwell小室放在24孔板中培養(yǎng)10 h后，用棉球擦去小室中未侵襲的細(xì)胞，并用4%多聚甲醛固定小室下方侵襲的細(xì)胞25 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。采用顯微鏡觀察，并隨機(jī)選取1個(gè)視野拍照，鏡下紫色信號的強(qiáng)度與侵襲通過小室基底膜的細(xì)胞數(shù)量成正比。

結(jié)果顯示，與空白對照組比較，ART膠束組、PTX/ART膠束組以及PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束組的紫色信號強(qiáng)度依次減弱，表明侵襲的細(xì)胞數(shù)量依次減少。各膠束對細(xì)胞的侵襲抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)镻FV修飾PTX/ART共載靶向膠束>PTX/ART膠束>ART膠束>PTX膠束>空白對照，結(jié)果見圖5。

3 討論

近年來，膠束作為化療藥物的運(yùn)送載體在抗腫瘤方面的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注，其疏水嵌段組成的聚合物膠束內(nèi)核能夠?yàn)殡y溶性藥物提供貯藏空間，而疏水性化療藥物的溶解度也在親水外殼的共同作用下明顯提高[8]?；诖?，本課題組將化療藥PTX和ART共同包埋于膠束內(nèi)，使這兩種藥物達(dá)到協(xié)同增效的目的。PFV是一種疏水性的電中性短肽，經(jīng)PFV修飾的脂質(zhì)體等遞藥系統(tǒng)能明顯增加細(xì)胞對藥物的攝取[4]。本課題組前期通過?；磻?yīng)合成了DSPE-PEG2000-PFV，其可嵌入膠束中使PFV修飾于膠束外周。本研究制備的PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束呈圓球形，粒徑在51 nm左右，有良好的粒徑分布和形態(tài)，藥物的包封率均大于90%，符合2015版《中國藥典》（四部）的要求[13]。

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，PTX的終濃度設(shè)置為10 ? ? ? ?μmol/L是為了保證在殺傷腫瘤細(xì)胞的前提下，還能保證本研究各項(xiàng)試驗(yàn)中有足夠的細(xì)胞存活量;在ART的Transwell小室預(yù)試驗(yàn)中，當(dāng)ART的濃度為100 μmol/L時(shí)，恰能抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此本研究在膠束的處方中設(shè)置ART的濃度為100 μmol/L。本研究結(jié)果顯示，空白膠束對BGC-823細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，這提示膠束膜材安全性較高，可作為運(yùn)送藥物的載體[14]。PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束中PTX濃度為0.63～10 ? ?μmol/L時(shí)，與其他膠束樣品比較具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。

因PTX和ART都不具有熒光活性，所以在細(xì)胞攝取和膠束靶向性試驗(yàn)中，本課題組選擇具有熒光活性的香豆素作為探針?biāo)幬?。香豆素作為熒光探針在研究脂質(zhì)體等給藥體系的藥物攝取情況中已有運(yùn)用，具有簡便、易操作的特點(diǎn)[15]。本研究通過流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡對PFV修飾香豆素/ART共載靶向膠束進(jìn)行定量和定性考察，發(fā)現(xiàn)香豆素的熒光強(qiáng)度在PFV修飾膠束組細(xì)胞中顯著增強(qiáng)，表明PFV修飾后可增加載藥膠束在腫瘤細(xì)胞中的分布，提高了藥物的腫瘤靶向性，并增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對藥物的攝取。此外，本研究通過細(xì)胞侵襲試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，載有ART的膠束均呈現(xiàn)出對細(xì)胞侵襲的抑制作用，這表明ART的加入可抑制BGC-823細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究成功制備了PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束，其具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能提高藥物的腫瘤靶向性和細(xì)胞對藥物的攝取能力，并且可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。但由于試驗(yàn)均在體外完成，并不能代表體內(nèi)結(jié)果，在接下來的研究中，筆者將進(jìn)一步展開PFV修飾PTX/ART共載靶向膠束的體內(nèi)抗腫瘤作用研究。

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（收稿日期：2020-05-12 修回日期：2020-09-21）

（編輯：林 靜）