1株三型丁香假單胞菌獼猴桃致病變種細(xì)菌全基因組掃描圖測(cè)序及分析

鄧博涵 劉丹蕾 陳秋菊

摘要：丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，簡(jiǎn)稱(chēng)Psa）是引起獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的病原菌。對(duì)從感染潰瘍病的東紅獼猴桃枝條中分離得到的1株P(guān)sa野生株（命名為GX05）進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得基因組草圖，分析其中毒力基因、耐藥基因和致病基因的情況。研究發(fā)現(xiàn)，多位點(diǎn)序列分型結(jié)果顯示GX05為biovar 3，與毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，GX05攜帶99種毒力因子及692個(gè)相關(guān)毒力基因，同源性和匹配度最高的毒力因子是PvdL和Irp1;與綜合抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，GX05攜帶336種耐藥基因，與29種抗生素有關(guān);與病原宿主互作數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，不表達(dá)導(dǎo)致病原菌致病力減弱的基因數(shù)量最多，其中同源性和匹配度最高的是PvdL，此外與增強(qiáng)致病力相關(guān)的同源性和匹配度最高的基因是hrcC。通過(guò)全基因組測(cè)序信息初步分析了1株三型Psa菌株中存在的毒力、耐藥及致病基因情況，對(duì)深入研究其致病機(jī)制和合理用藥有重要意義。

關(guān)鍵詞：丁香假單胞菌獼猴桃致病變種;獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病;全基因組測(cè)序;毒力基因;耐藥基因;致病基因

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.634.1+9?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）20-0067-08

獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病嚴(yán)重威脅著獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，給世界獼猴桃產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失[1]，丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，簡(jiǎn)稱(chēng)Psa）是獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的致病菌[2]。研究發(fā)現(xiàn)，原本健康的獼猴桃植株在春季初次出現(xiàn)潰瘍病癥狀（如葉斑）后，年底便會(huì)死亡。潰瘍病的傳播速度快、危害大，1年便可毀壞整個(gè)獼猴桃園[3-4]。目前還沒(méi)有直接殺滅病原菌的有效措施[5]，主要的防治方法包括以銅制劑為主的化學(xué)防治[6-7]、以鏈霉素為主的生物防治[8-9]、果園管理[10]和抗性品種選育[11]等?；瘜W(xué)和生物防治可造成植物毒性、藥物殘留、產(chǎn)生耐藥細(xì)菌等缺點(diǎn)，并且基因水平轉(zhuǎn)移可使耐藥基因在細(xì)菌間流動(dòng)[12]，目前已有報(bào)道表明部分Psa對(duì)鏈霉素[13]和銅制劑[14]產(chǎn)生了抗性。

尋找獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的有效防治途徑是全球獼猴桃產(chǎn)業(yè)面臨的重要任務(wù)。已發(fā)現(xiàn)的Psa有5種生物型，分別為biovar 1、biovar 2、biovar 3、biovar 5、biovar 6。我國(guó)目前只發(fā)現(xiàn)biovar 3群體[15]，但其致病機(jī)制尚不明確。有關(guān)Psa的研究主要集中在群體結(jié)構(gòu)、病原菌鑒定、防控藥物篩選等方面，對(duì)毒力基因、耐藥基因和致病基因的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)對(duì)1株從貴州省貴陽(yáng)市修文縣古堡鎮(zhèn)獼猴桃養(yǎng)殖基地采集的患病東紅獼猴桃（Actinidia chinensis “Donghong”）枝條中分離出的Psa進(jìn)行全基因組掃描圖測(cè)序，分別與毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)、綜合抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)和病原宿主互作數(shù)據(jù)庫(kù)等進(jìn)行比較，篩選出與毒力基因、耐藥基因和致病基因同源性最高的基因組，利用基因組信息從分子水平揭示病原菌的致病機(jī)制，為Psa的致病機(jī)制研究提供理論積累。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離純化

2018年3月在貴州省貴陽(yáng)市修文縣古堡鎮(zhèn)的獼猴桃園內(nèi)采集感染獼猴桃潰瘍病的東紅獼猴桃枝條。在無(wú)菌環(huán)境下，削取枝條病部，置于無(wú)菌的生理鹽水中，27 ℃振蕩10 min，接種于1.5%NB固體培養(yǎng)基（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）表面，參考馬志宏等的方法[16]進(jìn)行平板劃線(xiàn)純化。倒置平板于恒溫培養(yǎng)箱中，27 ℃培養(yǎng)24 h，挑單菌落于NB液體培養(yǎng)基中，于27 ℃恒溫?fù)u床中180 r/min搖菌 16 h。吸取最后一輪純化的菌液于無(wú)菌離心管中離心后棄上清，收集菌體沉淀用于提取DNA和浸染煙草試驗(yàn)。

1.2 菌株基因組DNA的提取與菌種鑒定

根據(jù)細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，用27F/1492R通用引物進(jìn)行16S rDNA測(cè)序[由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序]，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進(jìn)行核酸BLAST比對(duì)，篩選出屬于Psa的菌株。

1.3 煙草過(guò)敏反應(yīng)

細(xì)菌緩沖液（100 mL）成分包括1 mL的1 mol/L MgCl2、1 mL的1 mol/L 2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸一水（用KOH調(diào)整pH值至5.6）和100 μL的 100 μmol/L 乙酰丁香酮。用配制好的緩沖液將細(xì)菌沉淀懸浮，調(diào)整濃度為D600 nm=0.5，避光3～4 h后備用。在本氏煙草葉片背面用注射器針頭輕微劃傷，將無(wú)針注射器壓在傷口處，輕輕往里注射，使菌液直徑擴(kuò)散至2 cm左右。處理組（接種細(xì)菌懸浮液）和對(duì)照組（直接注射緩沖液）各選擇5個(gè)葉片進(jìn)行接種，24 h后觀(guān)察葉片的變化情況。

1.4 抗生素敏感性試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法，選擇11種抗生素進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)。用無(wú)菌的生理鹽水稀釋菌液至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋脽o(wú)菌涂布棒均勻涂抹菌液至整個(gè)NB瓊脂平板，鑷子滅菌后夾取各藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）于平板正中。每種藥敏片做3個(gè)平行，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)抑菌圈統(tǒng)計(jì)3個(gè)直徑，計(jì)算平均值，判斷抗生素敏感性[17]。

1.5 GX05全基因組測(cè)序

將GX05的基因組DNA送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司二代測(cè)序平臺(tái)Illumina Hiseq×10進(jìn)行測(cè)序。使用短序列組裝軟件SOAPdenovo2[18]對(duì)二代測(cè)序后的經(jīng)過(guò)濾得到的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行多個(gè) K-mer 參數(shù)的拼接，得到最優(yōu)的重疊群（contigs）組裝結(jié)果。隨后通過(guò)將測(cè)序讀長(zhǎng)（reads）比對(duì)到contig上，對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行局部組裝和優(yōu)化，獲得基因組骨架（scaffolds）。使用CGview[19]軟件繪制基因組圈圖。使用Glimmer 3[20]軟件預(yù)測(cè)編碼基因，使用Tandem Repeats Finder軟件[21]進(jìn)行串聯(lián)重復(fù)序列預(yù)測(cè)。按照管家基因在標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)seudomonas syringae pv. tomato DC3000基因組上的位置，使用biovar 1～biovar 6型以及Pfm菌株[15]的管家基因以gapA-pgi-rpoD-gyrB-pfk-acn的順序串聯(lián)[22]，使用MEGA 7.0用Tamura-Nei模型和近鄰法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[23]。比對(duì)病原菌毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)（virulence factors of pathogenic bacteria，簡(jiǎn)稱(chēng)VFDB）[24]，綜合抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)（comprehensive antibiotic resistance database，簡(jiǎn)稱(chēng)CARD）[25]和病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫(kù)（pathogen host interactions，簡(jiǎn)稱(chēng)PHI）[26]分別獲得毒力基因、耐藥基因和致病基因的信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 Psa菌株的分離與鑒定

經(jīng)過(guò)多輪純化后分離得到的Psa菌株在NB平板上的菌落形態(tài)呈光滑圓形，白色半透明狀。16S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示與Psa菌株（序列號(hào)：MH071159.1）相似度為98.24%，判斷為Psa菌株，命名為GX05。

2.2 煙草過(guò)敏反應(yīng)

圖1-a、圖1-b分別為注射細(xì)菌懸浮液（處理）和無(wú)菌緩沖液（對(duì)照）的煙草，注射范圍約2 cm，呈現(xiàn)出水漬狀。24 h后，處理組葉片的注射部位出現(xiàn)明顯的黃色枯斑，產(chǎn)生了過(guò)敏反應(yīng)（圖1-c），而對(duì)照組葉片注射無(wú)菌緩沖液的部位水漬消失，葉片

恢復(fù)正常狀態(tài)（圖1-d），說(shuō)明分離純化所得的Psa野生株GX05具有相應(yīng)的致病性。

2.3 抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果

由表1、圖2可知，Psa菌株GX05對(duì)磷霉素、多黏菌素、卡那霉素、氨曲南、羧芐青霉素、阿洛西林、美羅培南、頭孢噻肟等表現(xiàn)為敏感，對(duì)替考拉寧、桿菌肽和阿莫西林表現(xiàn)為耐藥。

2.4 Psa菌株GX05全基因組測(cè)序結(jié)果

Psa GX05進(jìn)行全基因組測(cè)序后，對(duì)獲得的片段進(jìn)行過(guò)濾和組裝，得到251條scaffolds，總長(zhǎng)度為 6 212 819 bp（圖3）， N50 為 46 356 bp。長(zhǎng)度大于 1 000 bp 的scaffolds有223條，共6 195 265 bp，最大的scaffold長(zhǎng)度為181 097 bp，鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶（G+C）含量為58.53%。經(jīng)預(yù)測(cè)，基因組的編碼基因總長(zhǎng)度為5 180 589 bp，共有5 725個(gè)。非編碼區(qū)有57個(gè)tRNA，9個(gè)rRNA，包括1個(gè)23S rRNA1個(gè)16S rRNA、7個(gè)5S rRNA，有195個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，占基因組的0.97%。根據(jù)多位點(diǎn)序列分型（MLST）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果可知，GX05屬于biovar 3型Psa（圖4）。

2.5 Psa菌株GX05毒力因子分析

VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到692個(gè)毒力基因，其中367個(gè)毒力基因注釋為99種毒力因子，52種毒力因子的功能分屬于攻擊型毒力因子（28種）、防御型毒力因子（11種）、非特異性毒力因子（11種）和調(diào)控毒力基因的毒力因子（2種），剩余的47種沒(méi)有功能歸類(lèi)。按照打分由高到低的條件篩選， 同源性和匹配

度最高的2個(gè)毒力因子與鐵載體（siderophore）有關(guān)：熒光鐵載體（pyoverdine，簡(jiǎn)稱(chēng)PVD）肽合成酶PvdL以及合成耶爾森菌素（yersiniabactin）有關(guān)的耶爾森菌素生物合成蛋白Irp1。另外經(jīng)統(tǒng)計(jì)，共匹配到51個(gè)PVD合成相關(guān)毒力基因（表2，未完全顯示，僅顯示同源性最高的10個(gè)基因）和4個(gè)非熒光鐵載體（pyochelin）合成相關(guān)的毒力因子[Fe（Ⅲ）-pyochelin receptor precursor、salicylate biosynthesis isochorismate synthase PchA、salicylate biosynthesis protein PchB、ABC transporter ATP-binding protein]。

2.6 Psa菌株GX05耐藥基因分析

通過(guò)與CARD數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，預(yù)測(cè)GX05攜帶366個(gè)耐藥基因，與29種抗生素有關(guān)（圖5）。經(jīng)ARO（Antibiotic Resistance Ontology）注釋?zhuān)珿X05有5種耐藥機(jī)制，分別為抗生素外排、抗生素靶標(biāo)改變、抗生素失活、抗生素靶標(biāo)替代和抗生素靶標(biāo)保護(hù)。外排泵系統(tǒng)的基因數(shù)量最多，主要包括macB（31個(gè)）、oleC（14個(gè)）、evgS（13個(gè)）、drrA（13個(gè)）等253個(gè)相關(guān)抗生素耐藥基因本體，其中根據(jù)score打分，同源性和匹配度最高的10個(gè)基因中與外排泵有關(guān)的基因是mexF、mexK、MexB、TriC、MexN。

2.7 Psa菌株GX05致病基因分析

PHI數(shù)據(jù)庫(kù)注釋預(yù)測(cè)GX05攜帶有959個(gè)與宿主病原菌互作相關(guān)的基因，屬于8種表現(xiàn)型：缺失導(dǎo)致病原菌致病力減弱的基因643個(gè)、對(duì)病原菌致病性沒(méi)有影響的基因172個(gè)、導(dǎo)致病原菌致病能力喪失的基因99個(gè)、使病原菌致病能力增強(qiáng)的基因68個(gè)、致病效應(yīng)基因34個(gè)、致死因子18個(gè)、抗藥基因3個(gè)、感藥基因2個(gè)。比對(duì)結(jié)果按照得分打分，同源性和匹配度最高的是不表達(dá)導(dǎo)致病原菌致病能力減弱的并與鐵載體有關(guān)的基因PvdL，此外與增強(qiáng)病原菌致病能力有關(guān)并且同源性和匹配度最高的基因是三型分泌系統(tǒng)通路上的基因hrcC。當(dāng)篩選作用宿主為擬南芥時(shí)，高度匹配得到5個(gè)基因，其中AvrE1、hrcC、HopD1等3個(gè)基因與植物感染后葉片出現(xiàn)細(xì)菌性斑點(diǎn)的癥狀有關(guān)（表3）。

3 討論與結(jié)論

由于紅陽(yáng)獼猴桃和黃金果獼猴桃的栽培面積最廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，所以全世界對(duì)獼猴桃潰瘍病的關(guān)注點(diǎn)主要集中于這2個(gè)品種，對(duì)其他患有獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的獼猴桃品種的研究較少。本研究是首次對(duì)從患病的東紅獼猴桃枝條中分離出的Psa（菌株命名為GX05）進(jìn)行全基因組掃描圖測(cè)序，并且著重分析耐藥基因以及同源性和匹配度最高的毒力基因和致病基因。

注射煙草和真空滲透葉盤(pán)的結(jié)果證明Psa菌株GX05有致病力。從使用MLST構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果來(lái)看，GX05屬于biovar 3。biovar 3是我國(guó)目前發(fā)現(xiàn)唯一存在的Psa群體[15]，也是目前全世界最普遍流行的Psa群體[27]。在5種生物型中，biovar 3的致病力最強(qiáng)[28]，但其致病機(jī)制尚不明確。Hacker等發(fā)現(xiàn)，病原菌的致病性取決于位于毒力島上的多種毒力基因[29-30]，而各種毒力因子的組合與平衡對(duì)于Psa的致病性（毒力）來(lái)說(shuō)很重要[27]。目前對(duì)感染潰瘍病的東紅獼猴桃的研究主要以調(diào)查其發(fā)病情況[31]和抗性評(píng)價(jià)[32]為主，針對(duì)致病菌Psa致病及乃耐藥機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究著重關(guān)注了導(dǎo)致東紅感染獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的Psa菌株的毒力和致病基因以及導(dǎo)致其產(chǎn)生耐藥性的原因。本次測(cè)序結(jié)果得到的GX05基因組大小為6 212 819 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中丁香假單胞菌的基因組大?。?.1 Mp）接近。根據(jù)全基因組測(cè)序結(jié)果，通過(guò)分析毒力基因和致病基因，篩選出3個(gè)同源性最高且最具代表性的基因：PvdL、Irp1、hrcC;分析耐藥基因發(fā)現(xiàn)，該菌攜帶多種類(lèi)型的耐藥基因，并且以外排泵系統(tǒng)基因?yàn)橹鳌?/p>

本研究預(yù)測(cè)到692個(gè)毒力基因，同源性和匹配度最高的基因與鐵載體的合成有關(guān)。Marcelletti等對(duì)2株P(guān)sa biovar 1和1株biovar 3菌株基因組的草圖進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它們均攜帶一組編碼鐵載體（鐵載體是假單胞菌屬細(xì)菌的重要毒力因子[34]）的基因，例如PVD、腸桿菌素（enterobactin）和耶爾森菌素[33]。Lamont等發(fā)現(xiàn)，PVD在銅綠假單胞菌中可以調(diào)控外毒素A、PrpL等其他毒力因子的表達(dá)[35];Wooldridge等發(fā)現(xiàn)，PVD參與調(diào)控生物膜的形成，增加病原菌的耐藥性[36]。從測(cè)序結(jié)果來(lái)看，GX05的基因組中共計(jì)匹配到51個(gè)合成熒光鐵載體相關(guān)毒力基因，覆蓋了PVD合成、分泌和作用途徑，其中PvdL的同源性最高。結(jié)合GX05中PVD的存在可以初步判定，Psa分離株具有與銅綠假單胞菌相似的毒力因子和致病機(jī)制，生物膜的形成是Psa產(chǎn)生耐藥性的主要原因。Irp1廣泛存在于假單胞菌屬的細(xì)菌中[37]，編碼耶爾森菌素生物合成蛋白[38]，與合成、攝取鐵載體有關(guān)[39]，引起番茄和擬南芥的細(xì)菌性葉斑病[40]。測(cè)序結(jié)果預(yù)測(cè)顯示，Irp1是與增強(qiáng)Psa致病力有關(guān)同源性最高的基因。因此，Psa可能通過(guò)Irp1來(lái)調(diào)控鐵載體和其他鐵吸收系統(tǒng)，從而在獼猴桃中繁殖并增強(qiáng)Psa的感染能力，這可能是Psa破壞力強(qiáng)大并造成毀園的主要原因。但目前Psa中還沒(méi)有Irp1功能研究的相關(guān)報(bào)導(dǎo)。此外，感染潰瘍病的獼猴桃葉片出現(xiàn)葉斑的原因也可能與Irp1有關(guān)。Mccann等研究發(fā)現(xiàn)，Psa通過(guò)Ⅲ型分泌效應(yīng)因子感染獼猴桃[41]，而hrcC蛋白是組成Ⅲ型分泌系統(tǒng)的外膜蛋白[42]，可以引起非宿主植物（如煙草）的過(guò)敏反應(yīng)并使宿主植物感病[43]。本次的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，同源性最高的互作基因是hrcC。因此，攜帶hrcC的Ⅲ型分泌系統(tǒng)可能是引起Psa感染獼猴桃并使得葉片出現(xiàn)細(xì)菌性斑點(diǎn)的原因之一。目前對(duì)于Psa的毒力因子和病原菌宿主互作的研究主要集中于Ⅲ型分泌系統(tǒng)中的avr和hop基因[27]，而hrcC的存在為完善Psa分泌系統(tǒng)通路提供了新的途徑。通過(guò)CARD預(yù)測(cè)到GX05攜帶多種耐藥基因，以外排泵系統(tǒng)產(chǎn)生抗生素耐藥性為主。外排泵能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的抗生素排出[44]，因此GX05可能主要靠外排泵系統(tǒng)產(chǎn)生耐藥性。藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GX05對(duì)替考拉寧、桿菌肽和阿莫西林表現(xiàn)出了耐藥性，這3種抗生素分別屬于糖肽類(lèi)抗生素、多肽類(lèi)抗生素和青霉類(lèi)抗生素，與預(yù)測(cè)到的信息相匹配。

首先從患病的東紅獼猴桃枝條中分離出Psa（菌株命名為GX05），并對(duì)其進(jìn)行煙草過(guò)敏反應(yīng)試驗(yàn)和抗生素敏感性試驗(yàn)，最后對(duì)其基因組進(jìn)行掃描圖測(cè)序。分析發(fā)現(xiàn)，其致病機(jī)制主要是與PVD的合成和分泌有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致葉片出現(xiàn)葉斑病的是Irp1致病基因。這為進(jìn)一步研究Psa的致病機(jī)制提供了新的思路，在未來(lái)可以尋找影響Psa的鐵載體和外排泵系統(tǒng)發(fā)揮作用的方法來(lái)治療獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病。

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