三孢布拉氏霉菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素工藝條件的優(yōu)化

劉春芬 慕金超

摘要：利用三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行探討，確定其最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，番茄紅素最大吸收波長(zhǎng)為508 nm;活化的凍干粉菌種在斜面培養(yǎng)基上于25 ℃培養(yǎng)5 d后，呈較好生長(zhǎng)狀態(tài)，菌絲粗壯，孢子生長(zhǎng)狀態(tài)飽滿(mǎn)，鏡檢顯示，其個(gè)體生長(zhǎng)狀態(tài)良好;擴(kuò)大培養(yǎng)120 h時(shí)孢子數(shù)量達(dá)到最高峰;發(fā)酵至36 h時(shí)添加阻斷劑效果最好，發(fā)酵至72 h時(shí)添加增氧劑效果最好。通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三孢布拉氏霉菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的最優(yōu)發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度25 ℃、pH值5.0、發(fā)酵時(shí)間5 d、接種量10.0%。

關(guān)鍵詞：番茄紅素;三孢布拉氏霉菌;發(fā)酵;工藝條件

中圖分類(lèi)號(hào)： TQ920.6;S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）20-0214-04

番茄紅素主要存在于植物細(xì)胞的有色體中，因具有抗癌、降低心血管疾病發(fā)病率、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、提高免疫力等生理功能，國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究熱度逐年遞增，目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)番茄紅素的方法有以下幾種：有機(jī)溶劑提取法、超臨界萃取法、化學(xué)合成法等，利用這些方法合成的番茄紅素存在化學(xué)物殘留問(wèn)題，品質(zhì)不高。采用生物合成中的微生物合成法，利用三孢布拉氏霉菌發(fā)酵產(chǎn)出番茄紅素，和其他的方法相比，具有不受季節(jié)控制、操作工藝簡(jiǎn)單、用時(shí)短、生產(chǎn)成本較為低廉等優(yōu)勢(shì)。另外相對(duì)其他幾種方法來(lái)說(shuō)，生物合成法可以獲得較高的番茄紅素得率，是生產(chǎn)番茄紅素的一種理想途徑。

本試驗(yàn)研究利用生物發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素時(shí)發(fā)酵條件、培養(yǎng)基成分、各類(lèi)抑制劑等對(duì)成品產(chǎn)量及品質(zhì)的影響，并對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，初步建立通過(guò)微生物發(fā)酵生物合成番茄紅素的基本工藝。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年6—10月進(jìn)行，試驗(yàn)地點(diǎn)為學(xué)院微生物實(shí)訓(xùn)中心。

1.2 材料及試劑

GM3.560三孢布拉氏霉（中國(guó)微生物菌種保藏中心，編號(hào)：ATCC 14059）;玉米粉、玉米淀粉（在超市或農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)）;番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：502-65-8，有效成分含量>98%，規(guī)格：20 mg/支）;可溶性淀粉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、淀粉均為分析純;瓊脂、維生素B1、酵母膏為生化試劑。

1.3 培養(yǎng)基

活化用培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1 g、七水硫酸鎂 0.5 g、可溶性淀粉15 g、酵母膏4.0 g，溶于 1 000 mL 蒸餾水中，加入瓊脂15 g，充分溶解。121 ℃ 滅菌20 min，制備斜面。

擴(kuò)大培養(yǎng)用培養(yǎng)基：除不添加瓊脂外，其他成分同活化用培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉40 g、淀粉糖化液40 g、可溶性淀粉50 g、磷酸二氫鉀0.5 g、七水硫酸鎂 0.25 g、維生素B1少量，溶于1 L蒸餾水中，加熱至完全溶解，調(diào)節(jié)pH值為6.5，分裝在10個(gè)錐形瓶中標(biāo)號(hào)1～10，冷卻備用。

2 試驗(yàn)方法

ATCC 14059→活化→擴(kuò)大培養(yǎng)→計(jì)孢子數(shù)→接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中→發(fā)酵→添加阻斷劑和增氧劑→發(fā)酵條件的優(yōu)化→發(fā)酵醪→過(guò)濾→濾液→減壓濃縮→成品

2.1 番茄紅素最大吸收波長(zhǎng)的確定

對(duì)番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品在480～520 nm范圍內(nèi)進(jìn)行最大吸收波長(zhǎng)的掃描[1-3]，找到番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收峰，由此確定番茄紅素的最大吸收波長(zhǎng)。

2.2 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)線性范圍的確定

取20 mg番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品置于50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，將其作為儲(chǔ)備液。用移液管移取1 mL儲(chǔ)備液置于50 mL容量瓶中，同樣用乙酸乙酯定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mL 置于 25 mL 容量瓶中，并用乙酸乙酯定容至刻度，然后于最大吸收波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 菌種的活化及擴(kuò)大培養(yǎng)

將0.1 mL無(wú)菌生理鹽水加入到凍干菌粉的安瓿瓶中，振蕩成懸浮狀，吸取全部菌體懸浮液，移至4支斜面培養(yǎng)基上，在25 ℃培養(yǎng)5～7 d[4-7]。將活化后的菌種接種到擴(kuò)大培養(yǎng)用培養(yǎng)基中，在25 ℃振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r/min。自培養(yǎng)48 h開(kāi)始每隔24 h取菌液計(jì)數(shù)，當(dāng)培養(yǎng)基中孢子數(shù)達(dá)109～1010個(gè)/mL 時(shí)，停止培養(yǎng)，此培養(yǎng)液備用。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)

向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種10%種子液，搖勻，在 25 ℃ 振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r/min[8]。

2.5 阻斷劑及增氧劑添加時(shí)間的確定

選用煙草廢棄物作為阻斷劑，在發(fā)酵培養(yǎng)24、30、36、42、48 h時(shí)分別向1～5號(hào)瓶中加入阻斷劑007 g，均進(jìn)行5 d發(fā)酵培養(yǎng)。過(guò)濾發(fā)酵液，棄去濾渣，將濾液減壓濃縮，分析確定阻斷劑添加時(shí)間。以不添加阻斷劑為空白對(duì)照。

分別在發(fā)酵培養(yǎng)的48、60、72、84、96 h時(shí)向6～10號(hào)瓶中各加入增氧劑30% H2O2 0.5 g，均進(jìn)行 5 d 發(fā)酵培養(yǎng)，分析確定增氧劑最佳添加時(shí)間。以不添加增氧劑為空白對(duì)照。

2.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

探討溫度（20、25、30 ℃）、pH值（4.5、5.0、55）、發(fā)酵時(shí)間（4、5、6 d）、接種量（7.5%、10.0%、125%）等因素[9-14]對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，分析確定采用三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的最佳條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 番茄紅素最大吸收波長(zhǎng)的確定

如圖1所示，番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品在508 nm處有最大吸收峰，因此番茄紅素的最大吸收波長(zhǎng)為508 nm。

3.2 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

采用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為508 nm處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度，得到如圖2所示結(jié)果。

3.3 菌種的活化培養(yǎng)

在斜面培養(yǎng)基上于25 ℃培養(yǎng)5 d后的凍干粉菌種呈較好的生長(zhǎng)狀態(tài)，菌絲粗壯，孢子生長(zhǎng)狀態(tài)飽滿(mǎn)。圖3顯示，該菌菌絲非常粗壯且長(zhǎng)度較大，菌絲無(wú)橫膈膜，屬于單細(xì)胞，具有多個(gè)細(xì)胞核，未發(fā)現(xiàn)假根。

3.4 種子的擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)間

從表1可以看出，從培養(yǎng)48 h開(kāi)始，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，孢子數(shù)呈對(duì)數(shù)遞增趨勢(shì)，到培養(yǎng)120 h時(shí)，孢子數(shù)量達(dá)到最高峰，隨后再延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，孢子數(shù)量沒(méi)有明顯的增加，說(shuō)明此時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分已經(jīng)較少，代謝產(chǎn)物積累較多，菌體開(kāi)始由對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)向穩(wěn)定生長(zhǎng)期，新生細(xì)胞數(shù)與死亡細(xì)胞數(shù)保持動(dòng)態(tài)平衡，孢子數(shù)量出現(xiàn)減少趨勢(shì)，可以推論，此后霉菌將進(jìn)入衰亡期，因此，選擇在培養(yǎng)120 h時(shí)終止培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液。

3.5 阻斷劑添加時(shí)間的確定

在508 nm處分別測(cè)定減壓濃縮后濾液的吸光度[15]，由于測(cè)得的吸光度過(guò)大，不在番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍內(nèi)，因此測(cè)定之前分別將5瓶發(fā)酵液稀釋2倍，得到圖4所示結(jié)果?？瞻讓?duì)照組發(fā)酵5 d后，經(jīng)測(cè)定吸光度為0.295。由圖4可見(jiàn)，比較試驗(yàn)組的吸光度與對(duì)照組發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過(guò)程中添加阻斷劑能有效阻斷胡蘿卜素的生成，從而使得產(chǎn)物仍為番茄紅素。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至36 h時(shí)添加阻斷劑效果最好，因此，選擇添加時(shí)間為發(fā)酵 36 h 時(shí)。

3.6 增氧劑添加時(shí)間的確定

在508 nm處分別測(cè)定減壓濃縮后濾液的吸光度，由于測(cè)得吸光度過(guò)大，不在番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍內(nèi)，因此測(cè)定之前分別將5瓶發(fā)酵液稀釋2倍，得到圖5所示結(jié)果。空白對(duì)照組發(fā)酵5 d后，經(jīng)測(cè)定吸光度值為0.287。由圖5可見(jiàn)，比較試驗(yàn)組的吸光度與對(duì)照組發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過(guò)程中添加增氧劑能有效增加番茄紅素的生成量。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至72 h時(shí)添加增氧劑效果最好，因此，選擇添加時(shí)間為發(fā)酵72 h時(shí)。

3.7 發(fā)酵條件的優(yōu)化

3.7.1 發(fā)酵溫度的確定 由圖6可知，在一定范圍內(nèi)當(dāng)發(fā)酵溫度升高時(shí)，番茄紅素的濃度也隨之增加;當(dāng)溫度上升到25 ℃時(shí)，番茄紅素的濃度達(dá)到最高值;如果溫度繼續(xù)升高，番茄紅素的濃度反而下降，這是因?yàn)槿卟祭厦咕淖钸m發(fā)酵溫度為 25～28 ℃，因此選擇25 ℃為其發(fā)酵最佳溫度。

3.7.2 發(fā)酵液pH值的確定 由圖7可知，當(dāng)發(fā)酵液pH值上升至5時(shí)，番茄紅素的濃度達(dá)到最高值;繼續(xù)升高pH值，番茄紅素的濃度反而下降，說(shuō)明三孢布拉氏霉菌的最適發(fā)酵pH值在5左右。

3.7.3 發(fā)酵時(shí)間的確定 由圖8可知，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至5 d時(shí)，番茄紅素含量達(dá)到最大值，其后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物含量不增反降，可能是由于番茄紅素本身不穩(wěn)定，發(fā)生了部分分解，因此，選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為5 d。

3.7.4 接種量的確定 由圖9可知，在一定范圍內(nèi)番茄紅素產(chǎn)量隨著接種量增加逐漸遞增，當(dāng)接種量增加到10%時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到最大，其后隨著接種量的持續(xù)增加，番茄紅素產(chǎn)量沒(méi)有明顯變化，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇接種量為10%。

3.7.5 發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果 由于測(cè)得吸光度不在番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍內(nèi)，因此測(cè)定之前分別稀釋2倍，得到表2所示結(jié)果。由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，影響三孢布拉氏霉菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素各因素的主次順序是C>A>B>D，即發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度>pH值>接種量。由k值可得，最佳組合方案為A2B2C2D2，即發(fā)酵溫度25 ℃、培養(yǎng)基pH值5.0、發(fā)酵時(shí)間5 d、接種量10.0%。

因?yàn)樽罴呀M合方案沒(méi)有在9組正交試驗(yàn)中出現(xiàn)，所以根據(jù)正交試驗(yàn)所得到的最佳條件因素做驗(yàn)證試驗(yàn)。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)測(cè)定得出，在最佳組合方案下吸光度為1.121，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的番茄紅素濃度為 17.61 μg/mL，比正交試驗(yàn)4號(hào)的 15.93 μg/mL 大。結(jié)果表明，發(fā)酵溫度25 ℃、培養(yǎng)基pH值5.0、發(fā)酵時(shí)間5 d、接種量10.0%是發(fā)酵最佳工藝參數(shù)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)確定了番茄紅素的最大吸收波長(zhǎng)為 508 nm;活化的凍干粉菌種在斜面培養(yǎng)基上于25 ℃培養(yǎng)5 d后，呈較好的生長(zhǎng)狀態(tài)，菌絲粗壯，孢子生長(zhǎng)狀態(tài)飽滿(mǎn)，鏡檢顯示，其個(gè)體生長(zhǎng)狀態(tài)良好;擴(kuò)大培養(yǎng)120 h時(shí)孢子數(shù)量達(dá)到最高峰;當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至36 h時(shí)添加阻斷劑效果最好，發(fā)酵進(jìn)行至 72 h 時(shí)添加增氧劑效果最好;通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三孢布拉氏霉菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度25 ℃、培養(yǎng)基pH值5.0、發(fā)酵時(shí)間5 d、接種量10.0%。

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