陸宏達 趙歡 張小俊

摘要：為探討正常與低品質(zhì)中華絨螯蟹的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異，采用高通量測序技術(shù)，測定細菌16S rDNA V3 V5區(qū)基因序列，通過生物信息學(xué)方法，分析比較腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性以及可培養(yǎng)菌群結(jié)構(gòu)的特點。結(jié)果表明，中華絨螯蟹正常組（NG）腸道中絕對優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（93.54%），而其他門的豐度均很低（2.81%以下），其中以厚壁菌門的乳球菌屬豐度最高（86.00%）;低品質(zhì)組（LG）以厚壁菌門（62.60%）、變形菌門（22.42%）、擬桿菌門（5.74%）和軟壁菌門（5.69%）為主，其中以厚壁菌門的尚無屬名的ZOR0006（46.20%）和變形菌門的Caedibacteraceae uncultured（21.33%）豐度最為優(yōu)勢，厚壁菌門的乳卵屬（5.81%）和乳球菌屬（4.63%）以及軟壁菌門的Candidatus Bacilloplasma屬（526%）豐度較高。低品質(zhì)組腸道中與營養(yǎng)代謝和生長相關(guān)的厚壁菌門顯著降低和擬桿菌門顯著增加，通過提高腸道中厚壁菌門和減少擬桿菌門豐度從而降低兩門間的豐度比，有望減少低品質(zhì)河蟹的出現(xiàn)?？膳囵B(yǎng)菌群的分析，正常培養(yǎng)組（NCG）絕對優(yōu)勢菌群為變形菌門（95.86%），其中以變形菌門的檸檬酸桿菌屬（61.40%）和氣單胞菌屬（3167%）為主，同樣低品質(zhì)培養(yǎng)組（LCG）類似于正常培養(yǎng)組，絕對優(yōu)勢菌群也為變形菌門（99.91%），以檸檬酸桿菌屬（50.02%）和氣單胞菌屬（36.16%）為主，但這2屬在正常組和低品質(zhì)組腸道中豐度很低，分別在0.01%～0.19%范圍內(nèi)，表明這2屬在培養(yǎng)基上極易培養(yǎng)，生長繁殖快，但在腸道中生長繁殖可能受到高豐度其他菌群的抑制作用，而處于低豐度狀態(tài)。研究結(jié)果可為調(diào)節(jié)低品質(zhì)中華絨螯蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)和制定減少低品質(zhì)中華絨螯蟹措施提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹;低品質(zhì);腸道;菌群結(jié)構(gòu);高通量測序

中圖分類號： S917;S182? 文獻標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0170-08

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹，20世紀(jì)90年代規(guī)?；斯し敝吵晒?，為河蟹大規(guī)模養(yǎng)殖奠定了基礎(chǔ)，經(jīng)過20多年的發(fā)展，養(yǎng)殖技術(shù)、河蟹規(guī)格、產(chǎn)量和品質(zhì)不斷提高，病害不斷減少，但在河蟹養(yǎng)成過程中，還經(jīng)常出現(xiàn)一些非病原引起的低品質(zhì)河蟹，不同的年份低品質(zhì)河蟹出現(xiàn)率不一樣，最高年份有些養(yǎng)殖區(qū)出現(xiàn)低品質(zhì)河蟹的池塘可達20%左右，一般養(yǎng)殖區(qū)出現(xiàn)低品質(zhì)河蟹的池塘在5%左右。這些河蟹主要表現(xiàn)為蟹體消瘦、肉質(zhì)鮮美度差、特有風(fēng)味減弱、肥滿度和肝胰腺指數(shù)顯著降低以及幾乎無死亡現(xiàn)象等特征，直接影響河蟹的商品價值和經(jīng)濟效益。患生物性疾病河蟹特征，除活力低和死亡率高外，很少全面地涉及到類似于低品質(zhì)河蟹的肉質(zhì)鮮美度差、肥滿度和肝胰腺指數(shù)低等特征的報道，患細菌性等生物性疾病的河蟹，通常屬于急性型或亞急性型疾病，一般死亡率50%左右，嚴(yán)重時在短期內(nèi)死亡率可高達80%以上[1-3]，與低品質(zhì)河蟹幾乎無死亡現(xiàn)象具有本質(zhì)的區(qū)別。造成低品質(zhì)河蟹的相關(guān)因素鮮有報道，只有影響河蟹風(fēng)味方面的研究，如養(yǎng)蟹塘中種植伊樂藻組的河蟹肌肉鮮味氨基酸含量和幾種肝胰腺脂肪酸含量等均顯著高于無伊樂藻組，但肝胰腺指數(shù)差異不顯著[4]，河蟹在8‰低鹽度海水暫養(yǎng)1～2周可以提高河蟹肌肉鮮味和甜味2個主要滋味[5]。已有研究表明生物腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)對機體的營養(yǎng)代謝、吸收和生長等有重要影響[6-8]，河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)與出現(xiàn)低品質(zhì)河蟹是否存在一定關(guān)系未見研究報道，本研究通過正常和低品質(zhì)河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)以及它們的可培育菌群結(jié)構(gòu)的比較分析，探討腸道菌群的差異性，有助于掌握低品質(zhì)河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)的特點，為改變河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而減少低品質(zhì)河蟹的產(chǎn)生提供理論依據(jù)，對提高河蟹品質(zhì)、商品價值、經(jīng)濟效益和河蟹養(yǎng)殖業(yè)健康持續(xù)發(fā)展等方面都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗蟹和腸道菌群的采集

1.1.1 試驗蟹 河蟹采用地籠的方式于2018年9月下旬采于江蘇省興化市安豐鎮(zhèn)的成蟹養(yǎng)殖塘，用地籠方法獲得的低品質(zhì)河蟹采自面積約為 0.52 hm2 且?guī)缀鯖]有發(fā)現(xiàn)正常河蟹的蟹塘，用相同方法獲得的正常河蟹采自面積約為0.50 hm2且沒有發(fā)現(xiàn)低品質(zhì)河蟹的蟹塘，這2個蟹塘的水深、水草種類和覆蓋率、水質(zhì)清澈度、透明度等養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖方法相似，蟹種來源于同一個蟹種養(yǎng)殖場。正常河蟹和低品質(zhì)河蟹各取20只，河蟹洗凈晾干后分別進行體質(zhì)量和殼長測定，再置于解剖盤中用70%的乙醇棉球擦拭河蟹體表進行消毒，無菌操作打開河蟹甲殼，取出肝胰腺稱質(zhì)量。正常河蟹和低品質(zhì)河蟹的體質(zhì)量、殼長、肥滿度和肝胰腺指數(shù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件作方差分析，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并用t檢驗法作差異性分析。

1.1.2 腸道菌群 每個河蟹甲殼打開后，無菌條件下取出河蟹整個腸道置于無菌培養(yǎng)皿中，用無菌眼科剪剪開腸道，挑去糞便，將剖開的腸道在存有無菌生理鹽水（4 ℃冰箱預(yù)冷）的3只離心管中分別進行刮洗后，菌液合并，離心濃縮，正常河蟹腸道洗下的所有菌群液合并于滅菌離心管中作為正常組（normal quality group，簡稱NG），低品質(zhì)河蟹采用相同方法得到的菌群液作為低品質(zhì)組（low quality group，簡稱LG）。取少量濃縮菌群液用作腸道的可培養(yǎng)菌群分析，其他保存于-80 ℃冰箱備用。

1.1.3 腸道可培養(yǎng)菌群 分別取正常組和低品質(zhì)組的少量濃縮菌群液，進行10倍倍比稀釋后，稀釋105以上的各稀釋度分別設(shè)3個平行，在胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，簡稱TSA）平板培養(yǎng)基和血瓊脂平板培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)120 h，將2種培養(yǎng)基所有生長的菌落用滅菌牙簽逐個挑出，洗入滅菌的生理鹽水中，離心濃縮后的菌群液分別作為正常培養(yǎng)組（normal quality culturable group，簡稱NCG）和低品質(zhì)培養(yǎng)組（low quality culturable group，簡稱LCG），保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 細菌DNA提取和PCR擴增

分別將正常組、低品質(zhì)組、正常培養(yǎng)組和低品質(zhì)培養(yǎng)組的濃縮菌群液進行DNA提取，300 μL菌群液中分別加入250 μL Buffer ATL和5 μL蛋白酶K，渦旋振蕩1 min至徹底混勻，55 ℃水浴30 min，95 ℃水浴20 min，加入250 μL Buffer DL和250 μL無水乙醇，渦旋混勻15 s;混合液轉(zhuǎn)入吸附柱HiPure gDNA Micro Colunm中，12 000 r/min離心1 min，倒棄收集管中的濾液，吸附柱裝回收集管中，加入 500 μL Buffer GW2，12 000 r/min離心1 min，倒棄濾液，再重復(fù)上一步驟1次，吸附柱裝回收集管中，12 000 r/min離心2 min;吸附柱裝在新的1.5 mL離心管中，加入300 μL Buffer AE于吸附柱中央，放置3 min，12 000 r/min離心1 min，得到白色絮狀物質(zhì)，晾干15 min，滴加100 μL dd H2O，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，并將各組細菌DNA提取液分別保存于-80 ℃冰箱備用。

采用上游引物341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和改進的下游引物806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′，對提取的各組細菌DNA進行16S rDNA序列的V3 V5可變區(qū)PCR擴增（PCR儀：ABI GeneAmp 9700型）。反應(yīng)體系為10 ng Template DNA，5 μmol/L上下游引物各0.8 μL，4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，04 μL FastPfu DNA Polymerase，補ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，共27個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。將每組PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒[愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司]切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測后，用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量。之后進行文庫構(gòu)建，連接“Y”形接頭，用磁珠篩選去除接頭自連片段，按照每個樣本測10 000條序列加入1 ng PCR產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)富集PCR產(chǎn)物，然后用NaOH溶液變性，獲得單鏈 DNA片段，測序工作由上海德培生物科技有限公司完成。

1.3 16S rDNA高通量測序及數(shù)據(jù)分析處理

用Illumina MiSeg高通量測序技術(shù)進行測序，原始數(shù)據(jù)通過質(zhì)控過濾、拼接和去除嵌合體，得到有效數(shù)據(jù)。利用Usearch 7.1（http：//drive5.com/uparse/）軟件平臺對有效數(shù)據(jù)進行操作分類單元（operational taxonomic unit，簡稱OTU）聚類，作為分類和計算的依據(jù)，采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學(xué)分析，并在各分類水平上統(tǒng)計每組樣品的菌群組成，覆蓋率（coverage）、物種豐富度（Chao）指數(shù)、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)和辛普森（Simpson）指數(shù)公式計算細菌多樣性指數(shù)，利用Excel、Venny 2.1、Canoco 5.0軟件分別分析制作稀釋性曲線和屬水平的相對豐度圖、韋恩（Venn）圖和主成分分析（principal component analysis，簡稱PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常河蟹與低品質(zhì)河蟹的特征

正常河蟹與低品質(zhì)河蟹經(jīng)顯微鏡檢查只發(fā)現(xiàn)極少量鐘形蟲寄生，肌肉和血淋巴液中的致病菌分離培養(yǎng)和回感試驗結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)致病菌，電鏡觀察檢查未見病毒和螺原體等細胞內(nèi)病原生物，表明低品質(zhì)河蟹不是由生物性病原引起。河蟹的特征見圖1，正常河蟹蟹殼堅硬，肝胰腺呈黃色或橘黃色，煮熟后具獨特的蟹腥香味口感，肝胰腺豐滿，低品質(zhì)河蟹消瘦，蟹殼軟，肝胰腺呈淺黃色或淺橘紅色，甚至有些河蟹肝胰腺呈乳白色，口感滋味和蟹腥香味差，肝胰腺明顯減少。正常河蟹與低品質(zhì)河蟹的殼長分別為（5612 5±0.172 0） cm、（5.602 3±0.333 9） cm，2組河蟹殼長無顯著差異（P>0.05），它們的體質(zhì)量分別為（10394±8.63） g和（87.09±10.22） g，體質(zhì)量有顯著差異（P<0.05），肥滿度分別為59.05±325和48.29±3.26，呈現(xiàn)極顯著差異（P<001），肝胰腺指數(shù)分別為0.102 5±0.012 6和0.053 2±0.007 3，呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）。

2.2 OTU聚類、分類學(xué)分析、多樣性指數(shù)分析

高通量擴增分析生成的原始數(shù)據(jù)，根據(jù)序列末端的box序列校正序列方向，然后按照barcode標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣本得到正常組和低品質(zhì)組的有效序列分別為40 468條和43 352條，正常培養(yǎng)組和低品質(zhì)培養(yǎng)組的有效序列分別為39 828條和 28 527 條。細菌序列平均片段長度無明顯差異，99.92%的序列長度聚集在420～430 bp之間，少數(shù)小于400 bp或者大于450 bp，以97%相似性水平為標(biāo)準(zhǔn)劃分可操作分類單元（OTU），正常組和低品質(zhì)組河蟹腸道中菌群OTU數(shù)量分別為113、87個，而相對應(yīng)的正常培養(yǎng)組和低品質(zhì)培養(yǎng)組菌群OTU數(shù)量分別為18、22個，分別低于它們相對應(yīng)的正常組和低品質(zhì)組菌群OTU數(shù)量（表1）。

基于隨機選取一定數(shù)量的測序序列及其對應(yīng)的OTU種類得到的稀釋性曲線（圖2），隨著測序深度的增加，各組曲線逐步趨于平坦，說明細菌序列和測序數(shù)據(jù)量合理并達到飽和，所進行的菌群多樣性分析結(jié)果可信，測序結(jié)果能夠真實地完整反映樣本中優(yōu)勢菌群的數(shù)量關(guān)系和菌群種類。在相同序列數(shù)時，正常組菌群OTU數(shù)量最多，說明其菌群豐富度最高，其次是低品質(zhì)組，再次是低品質(zhì)培養(yǎng)組，正常培養(yǎng)組最低。

由表1可見，無論是河蟹正常組和低品質(zhì)組菌群的序列，還是正常培養(yǎng)組和低品質(zhì)培養(yǎng)組菌群的序列，被測出的覆蓋率均達到了0.999 6以上，被測出的概率極高，反映本次測序結(jié)果代表了樣本中菌群真實情況。Chao指數(shù)通常用于估計OTU數(shù)目指數(shù)，正常組菌群的Chao指數(shù)高于低品質(zhì)組，表明正常河蟹菌群豐富度高于低品質(zhì)河蟹，但正常培養(yǎng)組菌群的Chao指數(shù)低于低品質(zhì)培養(yǎng)組，表明其菌群豐富度低于低品質(zhì)培養(yǎng)組。Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)則用于估計微生物多樣性，Shannon值越大而Simpson指數(shù)越小反映了樣品中微生物多樣性越豐富。正常組菌群的Shannon指數(shù)為0.76，小于低品質(zhì)組的Shannon指數(shù)2.0，而Simpson指數(shù)相反，正常組菌群的Simpson指數(shù)074，高于低品質(zhì)組的Simpson指數(shù)0.26，說明低品質(zhì)組菌群多樣性高于正常組，低品質(zhì)河蟹微生物多樣性更為豐富，其腸道內(nèi)有更多的細菌種類，菌群結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。

正常培養(yǎng)組菌群的Chao、Shannon、Simpson指數(shù)與低品質(zhì)培養(yǎng)組菌群的指數(shù)比較接近，反映了正常河蟹腸道中培養(yǎng)出的菌群結(jié)構(gòu)類似于低品質(zhì)河蟹腸道中培養(yǎng)出的菌群結(jié)構(gòu)。

2.3 菌群結(jié)構(gòu)組成及相對豐度

對各組的腸道菌群全部有效序列進行歸類操作分析，統(tǒng)計不同OTU所對應(yīng)的細菌門類及相對豐度，優(yōu)勢菌門類和相對豐度見表2。正常組和低品質(zhì)組河蟹腸道中前9個優(yōu)勢菌門類分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、軟壁菌門（Tenericutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、Patescibacteria group、放線菌門（Actinobacteria）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）。正常組和低品質(zhì)組河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)都以厚壁菌門優(yōu)勢度最高，相對豐度分別為93.54%和62.60%，前者豐度顯著高于后者;其次是變形菌門，分別為2.65%和22.42%，前者豐度顯著低于后者，2組的這2個門合計豐度分別占各自組總豐度的93.07%、86.18%;正常組擬桿菌門和軟壁菌門豐度分別為0.01%、0.13%，分別低于低品質(zhì)組5.74%、5.68%的豐度;2組在放線菌門、藍藻菌門和Patescibacteria group均只有極低的豐度;正常組的梭桿菌門和低品質(zhì)組的浮霉菌門均沒有豐度。2組的菌群結(jié)構(gòu)在門水平上具有較大的差異。

正常培養(yǎng)組和低品質(zhì)培養(yǎng)組河蟹腸道中培養(yǎng)菌群的優(yōu)勢菌群均是變形菌門，分別為95.86%和99.91%。前者的厚壁菌門豐度僅為4.14%，而其他7個門類均沒有豐度，無可培養(yǎng)菌群，后者的厚壁菌門、擬桿菌門和梭桿菌門豐度極低，有極少量的可培養(yǎng)菌群，軟壁菌門等其他5個門類均沒有豐度，無可培養(yǎng)菌群，2組的可培養(yǎng)菌群結(jié)構(gòu)在門水平上具有相似性。

篩選出每組豐度最高的前14種OTU所對應(yīng)的菌屬，在屬水平上對每組腸道菌群結(jié)構(gòu)及分布進行統(tǒng)計分析（圖3）。正常組腸道中乳球菌屬（Lactococcus）豐度最高，達到86.00%，低品質(zhì)組腸道中乳球菌屬豐度較低，為4.63%，后者豐度最高的菌屬是尚無屬名的ZOR0006，相對豐度達4620%，歸屬于厚壁菌門的韋榮球菌科（Erysipelotrichaceae），前者的ZOR0006相對豐度只有3.64%。低品質(zhì)組的Caedibacteraceae uncultured、乳卵屬（Lactovum）、Candidatus Bacilloplasma、Roseimarinus的豐度分別為21.33%、5.81%、5.26%和3.95%，均分別高于正常組只有0.01%、0.01%、0.12%、0.01%的豐度。除乳桿菌屬（Lactobacillus）在正常組豐度外，梭桿菌屬等其他8個屬在屬水平上均有一定的豐度，但均低于3.0%，2組的菌群結(jié)構(gòu)在屬水平上具有較大的差異。

正常培養(yǎng)組與低品質(zhì)培養(yǎng)組可培養(yǎng)菌群的優(yōu)勢菌群均為檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），豐度分別為61.40%、50.02%，其次是氣單胞菌屬（Aeromonas），豐度分別為31.67%、36.16%，2組這2個屬合計豐度分別為93.07%、86.18%。正常培養(yǎng)組乳球菌屬有4.14%的可培養(yǎng)菌群豐度，優(yōu)勢度較低，正常培養(yǎng)組假單胞菌屬（Pseudomonas）和低品質(zhì)培養(yǎng)組梭桿菌屬（Fusobacterium）、假單胞菌屬和腸球菌屬（Enterococcus）豐度均為0.01%，可培養(yǎng)菌群很少。2組的ZOR0006和乳卵屬等其他8個屬均沒有豐度，無可培養(yǎng)菌群。2組的可培養(yǎng)菌群結(jié)構(gòu)在屬水平上具有相似性。

2.4 河蟹腸道中菌群相關(guān)性分析

基于各組全部的OTU，通過構(gòu)建文恩（Venn）圖進一步比較和分析正常河蟹和低品質(zhì)河蟹腸道中細菌物種間差異性的相互關(guān)系。正常組和低品質(zhì)組河蟹腸道菌群共鑒定出OTU數(shù)量分別為113個和87個，其中前者特有的OTU數(shù)量為62個，占全部OTU數(shù)量的41.6%，后者特有的OTU數(shù)量為36個，占全部OTU數(shù)量的24.2%，二者共有的OTU數(shù)量為51個，占全部OTU數(shù)量的34.2%（圖4）。正常培養(yǎng)組和低品質(zhì)培養(yǎng)組河蟹腸道中培養(yǎng)菌群鑒定出OTU數(shù)量分別為18個和22個，前者特有的OTU數(shù)量為6個，占全部OTU數(shù)量的21.4%，后者特有的OTU數(shù)量為10個，占全部OTU數(shù)量的357%，二者培養(yǎng)菌群共有的OTU數(shù)量為12，占全部OTU數(shù)量的42.9% （圖5），以上數(shù)據(jù)表明正常河蟹和低品質(zhì)河蟹腸道中菌群結(jié)構(gòu)和種類有較大差別，正常培養(yǎng)組和低品質(zhì)培養(yǎng)組的培養(yǎng)菌群結(jié)構(gòu)和種類也有一些差別。

2.5 腸道中菌群差異性分析

各組間的關(guān)系主成分分析見圖6，PC1軸對樣品的貢獻率為67.04%，PC2軸對樣品的貢獻率為32.96%。正常組與低品質(zhì)組之間在PC1軸上和PC2軸上均相距較遠，它們間具有明顯的差異性。正常培養(yǎng)組和低品質(zhì)培養(yǎng)組之間距離很近，差異性不明顯，具有較高的相似性，它們在PC1軸上與正常組距離較遠，而在PC2軸上與低品質(zhì)組距離較遠，具有明顯的差異性。

3 討論

3.1 腸道菌群的分析方法

水生動物腸道內(nèi)細菌種類繁多， 包括可培養(yǎng)細菌和目前尚不為人知的大量不可培養(yǎng)細菌。對菌群的分析，從最初主要為了確定細菌性疾病的致病菌分析，采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)，再通過回感實驗和生理生化實驗鑒定致病菌的種類，例如王德銘等對草魚和青魚腸炎致病菌的分析[9];API20E系統(tǒng)鑒定[10]等技術(shù)，使細菌鑒定更為方便，但離不開細菌分離培養(yǎng);酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA）[11-12]等免疫酶技術(shù)在細菌檢測上得到了廣泛的應(yīng)用，但也必須首先通過細菌分離培養(yǎng)得到被檢測的細菌，通過制備對應(yīng)的抗體才能建立免疫酶檢測技術(shù)，因此這些技術(shù)都無法對不能培養(yǎng)的菌群進行檢測。PCR-DGGE分子生物學(xué)技術(shù)[13-14]，對可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)菌群都可檢測，但還存在一定的局限性，如不能分析痕量微生物，電泳條帶強弱判斷微生物的豐度也不是非常準(zhǔn)確，條帶中會包含1種以上16S rDNA序列，要獲悉具體的菌種信息，還需克隆和測序等繁瑣操作。隨著分子生物學(xué)的進一步發(fā)展，高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，以其高的檢測性、準(zhǔn)確性和測序深度等特點，目前已在水生動物腸道菌群結(jié)構(gòu)的分析研究中得到應(yīng)用，對包括痕量的可培養(yǎng)菌群和不能培養(yǎng)的未知菌群都能檢測，并可精確確定它們的豐度等信息[15]。采用高通量測序技術(shù)對河蟹腸道菌群分析，具有明顯的分析優(yōu)勢，能更準(zhǔn)確地反映河蟹腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的特點。

3.2 腸道菌群的影響因素

已有報道的養(yǎng)殖魚類腸道菌群影響因素的研究主要采用PCR-DGGE的方法，研究表明，不同月份[16]、食物[17-18]、養(yǎng)殖方式[19]等都會影響腸道菌群結(jié)構(gòu)的組成。河蟹腸道菌群影響因素鮮有研究報道，由于河蟹養(yǎng)殖類似于魚類養(yǎng)殖，河蟹腸道菌群同樣會受到所處的養(yǎng)殖水環(huán)境、餌料和養(yǎng)殖方式等因素的影響，河蟹經(jīng)過育苗、蟹種培育和成蟹養(yǎng)殖各個階段，生活周期長達2年左右，自蚤狀幼體從外界攝食起，腸道菌群開始定殖和微生態(tài)便開始逐步建立，蟹種腸道中的菌群主要受到蟹種培育池中的因素影響，在成蟹養(yǎng)殖過程中，成蟹腸道會在成蟹養(yǎng)殖池中重新建立菌群結(jié)構(gòu)，不同的養(yǎng)殖方法和養(yǎng)殖場條件，會使得成蟹腸道菌群產(chǎn)生差異，各自形成一個比較穩(wěn)定的菌群微生態(tài)系統(tǒng)。為了客觀地反映低品質(zhì)河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)的特點，作為對照的正常河蟹采自于塘大小、水深、種植水草的種類和覆蓋率、水質(zhì)清澈、高透明度等養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖方法等措施與低品質(zhì)河蟹的養(yǎng)殖條件和方法類似的池塘。

3.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)特點和減少低品質(zhì)河蟹的途徑

正常河蟹和低品質(zhì)河蟹腸道的主要優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和軟壁菌門，與人工感染白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus）的河蟹[20]和太湖河蟹[21]腸道的主要優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、軟壁菌門和擬桿菌門以及與餌料中添加果糖等成分的河蟹腸道主要優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和梭桿菌門[22]相似;與上海崇明養(yǎng)殖河蟹腸道中只有變形菌門和擬桿菌門菌群[23]以及養(yǎng)殖河蟹腸道中只發(fā)現(xiàn)屬于變形菌門γ-變形菌綱Gammaprotebacteria的菌群[24]有很大差異。不同報道中出現(xiàn)的這些差異，可能與試驗方法、試驗樣本數(shù)量、河蟹來源等不同存在一定的關(guān)系。正常河蟹與低品質(zhì)河蟹腸道菌群相對豐度比例上具有明顯差異性，主要表現(xiàn)在厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、軟壁菌門和梭桿菌門等菌門，其中厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度的差異是最值得注意的。報道的肥胖小鼠與瘦小鼠腸道菌群的比較研究中，肥胖小鼠厚壁菌門菌群豐度較大但擬桿菌門菌群豐度非常小，而瘦小鼠相反，認為厚壁菌門與擬桿菌門的比例與能量吸收有很大關(guān)系，比例的降低影響小鼠能量吸收和生長[6]，豬腸道菌群研究的報道中，與瘦豬比較，肥胖豬的體質(zhì)量增加與厚壁菌門菌群豐度存在正相關(guān)關(guān)系，而與擬桿菌門菌群豐度存在負相關(guān)關(guān)系[7]。在正常組和低品質(zhì)組河蟹腸道中這2個門的菌群豐度情況與肥胖小鼠和瘦小鼠以及肥胖豬和瘦豬腸道中的情況有著相似性，河蟹正常組厚壁菌門豐度達93.54%，擬桿菌門菌群豐度只有0.01%，二者的豐度比達9 000倍，而低品質(zhì)組厚壁菌門豐度為62.60%，擬桿菌門菌群豐度為5.74%，二者的豐度比只有10多倍，豐度比降低類似于肥胖小鼠和瘦小鼠以及肥胖豬和瘦豬的厚壁菌門與擬桿菌門豐度比降低的趨勢。厚壁菌門豐度減少，擬桿菌門豐度增加，推測對河蟹營養(yǎng)吸收和生長具有類似的負面影響，會引起河蟹養(yǎng)殖生產(chǎn)中出現(xiàn)肥滿度和肝胰腺指數(shù)低為主要特征的低品質(zhì)河蟹。通過調(diào)節(jié)這2個門的屬級菌群結(jié)構(gòu)，增加低品質(zhì)河蟹腸道中的厚壁菌門豐度，降低擬桿菌門的豐度，提高厚壁菌門與擬桿菌門豐度比，有望成為減少低品質(zhì)河蟹發(fā)生和發(fā)展的途徑之一。河蟹腸道中厚壁菌門由乳球菌屬、尚無屬名的ZOR0006、乳卵屬、乳桿菌屬和鏈球菌屬構(gòu)成，其中正常組最優(yōu)勢的菌屬為乳球菌屬，占86.00%的相對豐度，而低品質(zhì)組最優(yōu)勢的菌屬為無屬名的ZOR0006，占46.20%的相對豐度，除乳球菌屬在正常培養(yǎng)組中出現(xiàn)4.14%的可培養(yǎng)菌群豐度外，厚壁菌門的其他菌屬在正常培養(yǎng)組和低品質(zhì)培養(yǎng)組均為不可培養(yǎng)的菌群。擬桿菌門的優(yōu)勢菌屬主要是Roseimarinus屬，在正常組和低品質(zhì)組分別占001%和3.95%，為不可培養(yǎng)的菌群?，F(xiàn)有的細菌種名一般是以往通過分離培養(yǎng)后確定的，這些不可培養(yǎng)的菌群因無或缺乏相對應(yīng)的菌種名和核酸等數(shù)據(jù)資料，目前無法通過比對的方法確定它們的種名。厚壁菌門和擬桿菌門中絕大多數(shù)菌群的不可培養(yǎng)性和目前缺乏不可培養(yǎng)菌群的種級分類資料，無法通過培養(yǎng)方法得到大量菌群，使得采用口喂等人為的方法提高厚壁菌門豐度從而改善低品質(zhì)河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)變得困難，而降低擬桿菌門豐度相對容易，可通過深入研究使用藥物等方法得以實現(xiàn)。

益生菌具有提高食物消化吸收、促進生長和肥滿度，調(diào)節(jié)改善腸道菌群的結(jié)構(gòu)和平衡，提高機體免疫力、抗病率和抑制致病菌等作用。益生菌種類繁多，作用較為復(fù)雜和多樣，不同的益生菌種類作用有很大差異。在促進生長和提高肥滿度方面，可選擇提高食物消化吸收促進生長的那些益生菌，能夠?qū)⒉荒芑虿灰捉到庀盏拇蠓肿游镔|(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子，便于機體的吸收和利用，提高飼料轉(zhuǎn)化率，其次益生菌本身富含營養(yǎng)物質(zhì)，添加到飼料中可作為營養(yǎng)物質(zhì)被攝取吸收利用，同時益生菌在腸道內(nèi)生長繁殖能夠產(chǎn)生如維生素、氨基酸以及促生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)參與機體的新陳代謝和生長。如已有報道在飼料中添加屬于乳桿菌屬的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus） [25]和屬于芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） [26]，可增加凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）腸道中的蛋白酶和淀粉酶等酶的活性，提高生長率。厚壁菌門的乳桿菌屬在正常組河蟹腸道中相對豐度為3.69%，是低品質(zhì)組河蟹腸道中相對豐度（2.15%）的1.7倍，盡管不知其對消化吸收和生長有多大程度的影響，但通過飼料中添加乳桿菌和芽孢桿菌等提高食物消化吸收促進生長的益生菌，是減少低品質(zhì)河蟹值得探索的途徑之一。

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