李建華,張智明,何世岷,竇海燕,方超,劉旭
(哈藥集團生物疫苗有限公司研發(fā)中心,哈爾濱150069)
豬細小病毒L株E0代,批號:PPV-E1-201301,由哈藥集團生物疫苗有限公司制備、鑒定和保存;檢驗用強毒:豬細小病毒7909株,批號:PPV-Q-201201,規(guī)格:2.0 mL·支-1,紅細胞凝集價為1:512,病毒含量107.75TCID50/mL,由哈藥集團生物疫苗有限公司制備、鑒定和保存。
豬細小病毒陽性血清,HI效價:1:512,規(guī)格1.0 mL·支-1;豬細小病毒陰性血清規(guī)格1.0 mL·支-1,均來源于東北農(nóng)業(yè)大學。
0.5%豚鼠紅細胞懸液,按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行制備。
MontanideTMISA 206 VG佐劑,購自法國賽比克公司;二乙烯亞胺,購自FLUCA公司。
TG(硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基)、GA(酪胨瓊脂)、GP(葡萄糖蛋白胨湯),均由哈藥集團生物疫苗有限公司提供。
購自北京海淀中海動物保健科技公司。
妊娠40日初產(chǎn)母豬(豬瘟中和抗體陰性、豬細小病毒HI抗體不超過1:8),購自黑龍江省哈爾濱市郊某豬場,品種為長白;350~400 g成年豚鼠(豬細小病毒HI抗體不高于1:8),由哈藥集團生物疫苗有限公司實驗動物中心提供。
將豬細小病毒L株原始毒種E0代按培養(yǎng)液體積0.5%的比例接種到新消化的ST細胞懸液中(2.0×105個細胞·mL-1),置37℃靜置培養(yǎng),每日觀察1~2次。培養(yǎng)48 h后,收獲含病毒的細胞培養(yǎng)液和細胞,收獲的病毒液反復凍融3次,吸取部分病毒液做無菌檢驗。將檢驗無菌的病毒液作為E1代病毒液,并按以上方法在ST細胞上連續(xù)傳代至E12代。每代分別留樣用于檢驗,剩余病毒液置于-20℃凍存。取E1~E12代病毒液進行病毒含量和紅細胞凝集價測定,對E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液進行了毒力、免疫原性、特異性和純凈性檢測。
將各代毒種用MEM細胞培養(yǎng)液作10倍系列稀釋,取10-5、10-6、10-7 3個稀釋度,各加入96孔細胞培養(yǎng)板,每個稀釋度6孔,每孔100μL,同時設6孔加100μL MEM作為無病毒空白對照。每孔加入100μL新消化的ST細胞懸液(4.0×105個·mL-1),置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5日,每日觀察和記錄各孔中病毒感染情況,取最高細胞病變時間點,按Reed-Muench法,計算病毒的致半數(shù)細胞感染滴度(TCID50)。
將毒種作2倍系列稀釋,按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄測定對0.5%豚鼠紅細胞的凝集價。
取妊娠40日的初產(chǎn)母豬(豬瘟中和抗體陰性、豬細小病毒HI抗體效價低于1:8)5頭,經(jīng)鼻內(nèi)接種2.0 mL病毒液(每mL病毒含量106.0TCID50)。攻毒后觀察妊娠母豬是否產(chǎn)出死胎或胎,記錄胎兒生長情況,并采集胎兒肝臟、腎臟、腸系膜淋巴結等組織,用PCR方法檢測是否感染豬細小病毒。
將病毒液按本規(guī)程制備疫苗。用細小病毒血凝抑制(HI)抗體陰性體重350~400 g的豚鼠5只,各肌肉注射疫苗0.5 mL。28日后,連同條件相同的對照豚鼠2只,采血,測定HI抗體效價。
將毒種用MEM稀釋成200TCID50/0.1 mL,分別與等量豬細小病毒陽性血清和豬細小病毒陰性血清混合,置37℃水浴作用1 h后,加入96孔細胞培養(yǎng)板6個孔內(nèi),其后每孔加入100μL新消化的ST細胞懸液(4.0×105個·mL-1)。同時設正常細胞對照,置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5日。
按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗。
按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗。
2.9.1樣品的處理
取保存的F0代毒種3瓶,混合后用相應的的特異性抗血清中和后作為檢品。
2.9.2接種的細胞與樣品的培養(yǎng)
接種的細胞將檢品接種以下細胞:Vero細胞、MDBK細胞、PK15細胞。樣品的接種與培養(yǎng),將1.0 mL已處理的被檢樣品接種到已長成單層的上述細胞,另設1瓶未接種的正常細胞對照,并培養(yǎng)不少于14日,其間應至少繼代1次。最后1次繼代的細胞單層數(shù)量和培養(yǎng)面積應符合熒光抗體檢查法、致細胞病變檢查法和紅細胞吸附性外源病毒檢驗的要求。判定在至少14日的培養(yǎng)期內(nèi),要對細胞培養(yǎng)物進行常規(guī)檢查,如果培養(yǎng)期間出現(xiàn)細胞病變即判定為不符合規(guī)定。如無細胞病變,培養(yǎng)結束,時,細胞單層應按2.9.3進行檢驗。
2.9.3檢查方法
熒光抗體檢查法最后1次繼代的細胞單層培養(yǎng)5~7日后用于熒光抗體檢查。對每一種特定外源病毒的檢驗應至少包含3組細胞:1.被檢樣品處理細胞;2.在最后1次繼代時接種100~300 FAID50特定病毒的陽性對照細胞;3.未加樣品的陰性對照細胞。每一組細胞單層檢查面積應不小于6 cm2。
每一組細胞應按下列規(guī)定選擇特異的抗病毒熒光抗體:①所有細胞均應檢驗:牛病毒性腹瀉病毒(BVDV);②豬源細胞:豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)。
細胞單層樣品經(jīng)甲醇定后,用適宜的熒光抗體進行染色,檢查每一組細胞單層是否存在特定外源病毒的熒光。當陽性對照出現(xiàn)特異熒光,正常細胞無熒光時,如果被檢樣品出現(xiàn)外源性病毒特異性熒光,判為存在相應病毒污染而樣品不合格。如果陽性對照組熒光不明顯,或者正常細胞出現(xiàn)明顯熒光,判為無結果,應重檢。
致細胞病變檢查法取經(jīng)傳代后培養(yǎng)至少7日的敏感細胞單層(每個至少6 cm2)進行檢驗。用適宜染色液對細胞單層進行染色。觀察細胞,檢查包涵體、細胞融合形成的巨細胞、局部細胞壞死脫落或其他由外源病毒引起的CPE的出現(xiàn)情況。如果出現(xiàn)外源病毒所致的特異性CPE,判為樣品不合格;如果疑有外源病毒污染,又不能通過其他試驗排除這種可能性時,則判為樣品不合格。
紅細胞吸附性外源病毒檢驗取經(jīng)傳代后培養(yǎng)至少7日的敏感細胞單層(每個至少6 cm2)進進行檢驗。以PBS(pH 7.2,下同)洗滌細胞單層2~3次。加入適量0.2%的豚鼠紅細胞和雞紅細胞的等量混合懸液,以覆蓋整個單層表面為準,紅細胞懸液可在加入前混合,亦可以分別滴加于不同的細胞單層上。選2個細胞單層,分別在2~8℃和20~25℃放置30 min后,用PBS洗滌,檢查紅細胞吸附情況。如果出現(xiàn)外源病毒所致的紅細胞吸附現(xiàn)象,判為樣品不合格;如果疑有外源病毒污染,又不能通過其他試驗排除這種可能性時,則判為樣品不合格。
將豬細小病毒L株E0代毒種在ST細胞上連續(xù)傳代至E12代,進行各代病毒液病毒含量的測定,結果見表1。
將豬細小病毒L株E0代毒種在ST細胞上連續(xù)傳代至E12代,進行各代病毒液紅細胞凝集價的測定,結果見表2。
表1病毒含量的測定結果
表2紅細胞凝集價測定結果
E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液進行毒力的測定。結果表明,E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液均能至少引起4/5的妊娠母豬產(chǎn)下死胎或弱胎,且采集胎兒組織PCR檢測豬細小病毒為陽性,E1、E3、E5、E7代病毒液的毒力測定結果見“豬細小病毒L株基礎種子批的系統(tǒng)鑒定報告”,E9和E12代病毒液毒力測定結果見表3。
將E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液,按照本規(guī)程方法制備疫苗進行免疫原性測定。結果表明,E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液經(jīng)滅活后制備的疫苗均能使3/4以上注射豚鼠出現(xiàn)抗體反應,其HI效價均高于1:64。E1、E3、E5、E7代病毒液的免疫原性測定結果見“豬細小病毒L株基礎種子批的系統(tǒng)鑒定報告”,E9及E12代病毒液的免疫原性測定結果見表4。
將豬細小病毒L株E0代毒種在ST細胞上連續(xù)傳代至E12代,將各代病毒液進行特異性檢驗,結果表明各代次病毒液均可被豬細小病毒陽性血清完全中和,接種ST細胞觀察5日不產(chǎn)生細胞病變,特異,結果見表5[1-4]。
各代毒種按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗,結果見表6。
表3毒力測定結果
表4免疫原性測定結果
表5特異性檢驗結果
表6無菌檢驗結果
各代病毒液按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行支原體檢驗,結果見表7。
表7支原體檢驗結果
熒光抗體檢查法檢測結果結果見表8。
表8熒光抗體法檢測結果
致細胞病變法檢測結果結果見表9。
紅細胞吸附性外源病毒檢測結果結果見表10。
表9致細胞病變法檢測結果
表10紅細胞吸附性外源病毒檢測結果
豬細小病毒L株E1~E12代病毒液,病毒含量為107.36~107.60TCID50/mL、紅細胞凝集價在1:512~1:1 024;E1、E3、E5、E7、E9和E12代 病 毒液,毒力穩(wěn)定、免疫原性良好、特異、純凈。為進一步確保L株作為生產(chǎn)用毒種的遺傳穩(wěn)定性,將其作為生產(chǎn)用毒種的基礎代次限定為E1~E5代,生產(chǎn)代次限定為E6~E8代,生產(chǎn)毒種最高使用代次不超過3代。