杜少帥，林益達(dá)，于軍偉，杜 欣， 楊曉瑩，吉萬全，王長有

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.農(nóng)業(yè)部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制陜西科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，陜西楊凌 712100)

小麥條銹病是由小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst))引起的最具毀滅性的小麥真菌病害之一，可導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。培育、種植抗條銹病品種是控制小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)、有效的策略，然而，因?yàn)椴≡拘孕》N的變異，大多數(shù)品種(基因)會(huì)很快或最終喪失條銹病抗性[1,2]。因此，迫切需要培育新的抗條銹病材料或品種。

濱麥(Leymusmollis(Trin.) Pilger,2n=4x=28,NsNsXmXm) 是禾本科(Poaceae)小麥族(Triticeae)的一個(gè)異源四倍體材料，農(nóng)藝性狀優(yōu)良，且對(duì)小麥條銹病(stripe rust)、白粉病(powdery mildew)等多種真菌病害表現(xiàn)高抗或免疫，是改良普通小麥(TriticumaestivumL.)的重要種質(zhì)資源。濱麥在小麥遠(yuǎn)緣雜交中有著廣泛的應(yīng)用，通過染色體工程產(chǎn)生了諸多類型的小麥-濱麥衍生材料(八倍體小濱麥[3]、部分雙二倍體[3]、附加系[4-7]、代換系[8-10]、易位系[11-12]和漸滲系)。攜帶濱麥抗條銹基因的小麥-濱麥衍生材料是小麥抗性育種重要的橋梁材料，其中，易位材料攜帶較少的不利基因，有較大的育種價(jià)值，關(guān)于小麥-濱麥易位材料的報(bào)道較少。易位材料通常由附加系和代換系衍生而來[13]。人工誘導(dǎo)產(chǎn)生易位如殺配子染色體[11，14-16]誘發(fā)易位的頻率較高，而染色體自發(fā)易位的頻率較低，但也有一定幾率發(fā)生[12,17]。

M13063A-1來自于小麥-濱麥二體異附加系M13063-3-3[18]經(jīng)過2年嚴(yán)格自交的衍生后代。M13063-3-3是普通小麥7182和濱麥雜交后，用普通小麥山農(nóng)20雜交一次，然后多年自交得到的小麥-濱麥衍生系，附加了一對(duì)濱麥第6部分同源群染色體，抗條銹菌生理小種條中31(CYR31)、條中32(CYR32)和條中33(CYR33)。本研究運(yùn)用細(xì)胞學(xué)、原位雜交和分子標(biāo)記等技術(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)以及條銹病抗性調(diào)查，對(duì)自發(fā)易位系M13063A-1進(jìn)行了鑒定，為該材料在小麥改良育種和抗病育種中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

普通小麥7182、輝縣紅和小麥-濱麥衍生后代M13063A-1均于2018-2019年種植在西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)田，濱麥種植于室內(nèi)光照培養(yǎng)箱中，PCR引物、華山新麥草(Psathyrostachyshuashanica,2n=2x=14,NsNs)基因組DNA、烏拉爾圖小麥(Triticumurartu,2n=2x=14,AA)基因組DNA、粗山羊草(Aegilopstauschii,2n=2x=14,DD)基因組DNA和以上所有材料都由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥遠(yuǎn)緣雜交與染色體工程實(shí)驗(yàn)室提供。條銹菌生理小種CYR31和CYR32，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞學(xué)鑒定

分別于3月下旬和4月中旬在田間取材料的根尖和幼穗。根尖、幼穗的固定和鏡檢按照Yang等[3]的方法進(jìn)行。用Olympus BX-43 (Japan)顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 原位雜交

種子在23 ℃萌發(fā)2～3 d，直至幼根長至2～3 cm，將根尖分生區(qū)切下，根尖的固定按照Zhang等[19]的方法進(jìn)行。染色體制片采用滴片法[20]。基因組原位雜交(genomicinsituhybridization,GISH)按照Yang等[3]的方法進(jìn)行。熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)按照Han等[21]的方法進(jìn)行，結(jié)果參考Tang等[22]發(fā)表的普通小麥中國春和綿陽11的FISH核型。用Olympus BX53(Japan)熒光顯微鏡觀察并拍攝圖像，用Photoshop CC(Adobe,USA)分析并處理圖像。

原位雜交探針：按照Yang等[4]的方法，用CTAB法提取幼嫩葉片的DNA。用濱麥基因組DNA探針(綠)進(jìn)行減數(shù)分裂中期ⅠGISH；用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2(綠)、Oligo-pTa535(紅)和濱麥基因組DNA探針(綠)進(jìn)行連續(xù)的FISH和GISH(FISH-GISH)；用華山新麥草基因組DNA探針(綠)進(jìn)行GISH；用烏拉爾圖小麥基因組DNA探針(綠)，濱麥基因組DNA探針(綠)和粗山羊草基因組DNA探針(紅)進(jìn)行多色GISH(multi-color GISH,mc-GISH)。以濱麥基因組DNA探針(綠)、Oligo-pSc119.2(綠)分別和三種寡核苷酸探針Oligo-pTa71-2[22](紅，著絲粒探針)、Oligo-119[23](紅)、Oligo-60[23](紅)結(jié)合進(jìn)行GISH，來探究2B、6B和7B染色體的FISH信號(hào)模式以及易位染色體中小麥染色體片段的來源，試驗(yàn)結(jié)果分別參考Oligo-pTa71-2、Oligo-119、Oligo-60在B基因組染色體上產(chǎn)生的信號(hào)模式[22-23]進(jìn)行分析。

1.2.3 分子標(biāo)記分析

分布在小麥第6同源群染色體上的18個(gè)PLUG標(biāo)記、176個(gè)EST標(biāo)記和106個(gè)SSR標(biāo)記被用來確定M13063A-1所攜帶的濱麥染色體片段的同源群歸屬。PCR和電泳分析按照Zhu等[24]的方法進(jìn)行。

1.2.4 農(nóng)藝性狀和條銹病抗性鑒定

在2019年6月收獲植株后，調(diào)查并記錄M13063A-1和普通小麥7182的株高、分蘗、穗長、小穗數(shù)、小穗粒數(shù)。M13063A-1與普通小麥7182之間的差異顯著性用T檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

在試驗(yàn)植株成株期，于田間環(huán)境條件下接種條銹菌生理小種條中31和條中32的混合菌種進(jìn)行M13063A-1的成株期條銹病抗性鑒定，以感病對(duì)照輝縣紅作誘發(fā)行，將孢子均勻地撒在噴濕的植株上進(jìn)行人工誘發(fā)。當(dāng)輝縣紅充分發(fā)病時(shí)，按照Bariana等[25]的“0～4”級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)M13063A-1、7182和輝縣紅進(jìn)行抗病等級(jí)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果

根尖分生區(qū)細(xì)胞染色體數(shù)目觀察結(jié)果(圖1a)顯示，M13063A-1體細(xì)胞中含有44條染色體?；ǚ勰讣?xì)胞鏡檢結(jié)果(圖1b)顯示，其減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體配對(duì)構(gòu)型為2n=44=22Ⅱ，其中一對(duì)染色體提前分離；在減數(shù)分裂后期Ⅰ(圖1 c)同源染色體可以均等分離。此外，在減數(shù)分裂中期Ⅰ細(xì)胞中沒有觀察到多價(jià)體形成。這些結(jié)果說明M13063A-1在細(xì)胞學(xué)上穩(wěn)定遺傳。

a:有絲分裂中期；b：減數(shù)分裂中期Ⅰ；c：減數(shù)分裂后期Ⅰ。箭頭指示提前分離染色體。

2.2 原位雜交結(jié)果

用濱麥基因組DNA探針對(duì)M13063A-1根尖細(xì)胞染色體組進(jìn)行GISH，結(jié)果(圖2b)顯示，M13063A-1含有兩條易位染色體。用濱麥基因組DNA探針對(duì)M13063A-1幼穗細(xì)胞染色體組進(jìn)行GISH，結(jié)果(圖2a1～圖2a4)顯示，兩條易位染色體在減數(shù)分裂中期Ⅰ配對(duì)成二價(jià)體(圖2a1～圖2a3)，在減數(shù)分裂后期Ⅰ均等分離到細(xì)胞兩極(圖2a4)，這表明M13063A-1可以穩(wěn)定遺傳。在減數(shù)分裂中期Ⅰ，有一對(duì)普通小麥染色體提前分離(圖2a3)，在實(shí)際觀察中，也有一對(duì)易位染色體提前分離的情況出現(xiàn)(未提供照片)。在減數(shù)分裂中期Ⅰ細(xì)胞的GISH結(jié)果中，并未觀察到多價(jià)體的形成。用華山新麥草基因組DNA探針對(duì)M13063A-1根尖細(xì)胞染色體組進(jìn)行GISH(圖2c)，也觀察到兩條易位染色體，這表明M13063A-1攜帶的濱麥染色體片段來自Ns基因組染色體。

a1、a2、a3：用濱麥基因組DNA探針進(jìn)行減數(shù)分裂中期Ⅰ原位雜交；a4：用濱麥基因組DNA探針進(jìn)行減數(shù)分裂后期Ⅰ原位雜交；b：用濱麥基因組DNA探針進(jìn)行有絲分裂中期原位雜交；c：用華山新麥草基因組DNA探針進(jìn)行有絲分裂中期原位雜交。紅色箭頭指示提前分離的一對(duì)普通小麥染色體。

FISH-GISH結(jié)果(圖3a、圖3b)顯示，M13063A-1含有42條普通小麥染色體和一對(duì)易位染色體。易位染色體長臂是濱麥染色體片段，短臂是普通小麥染色體片段。寡核苷酸探針Oligo-pTa535在易位染色體長臂末端即濱麥染色體端部產(chǎn)生了微弱的紅色信號(hào)。42條普通小麥染色體中，2B、6B、7B染色體暫時(shí)不能分辨清楚(如圖3a中白色六角星所示)。圖3c是根據(jù)圖3a和圖3b整理的M13063A-1的核型，寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2(綠)和Oligo-pTa535(紅)可以區(qū)分M13063A-1中的42條普通小麥染色體，并且B基因組染色體上的綠色信號(hào)各不相同，這說明只用Oligo-pSc119.2就可以區(qū)分B基因組染色體。

用烏拉爾圖小麥基因組DNA探針(綠)、濱麥基因組DNA探針(綠)和粗山羊草基因組DNA探針(紅)進(jìn)行mc-GISH，結(jié)果(圖4a)顯示，A基因組染色體(顯示白色)、B基因組染色體(顯示藍(lán)色，即無信號(hào))和D基因組染色體(顯示紅色)分別有14條，且濱麥基因組DNA探針(綠)在易位染色體長臂上產(chǎn)生了明亮的綠色信號(hào)，在短臂上無信號(hào)(顯藍(lán)色)，說明易位染色體的短臂可能來源于B基因組染色體。因?yàn)橹挥霉押塑账崽结極ligo-pSc119.2就可以區(qū)分B基因組染色體，所以用濱麥基因組DNA探針(綠)、Oligo-pSc119.2(綠)分別和三種在B基因組染色體上產(chǎn)生特異信號(hào)的寡核苷酸探針Oligo-pTa71-2(紅)、Oligo-119(紅)、Oligo-60(紅)結(jié)合進(jìn)行GISH，確定了M13063A-1中2B、6B和7B染色體的FISH信號(hào)模式(圖4b1～圖4b3、圖4c)。如圖4b1和圖4c所示，隨體探針Oligo-pTa71-2在1BS、6BS和易位染色體短臂上都產(chǎn)生了明顯的紅色信號(hào)，但1BS上的紅色信號(hào)明顯比6BS和易位染色體強(qiáng)烈，說明易位染色體的短臂是6BS，而且紅色信號(hào)產(chǎn)生在易位染色體短臂的末端，說明易位染色體不含有6B的隨體。

a：FISH；b：GISH；c：核型。白色箭頭指示易位染色體，白色六角星指示暫時(shí)不能分辨的3對(duì)普通小麥染色體。T表示易位染色體。

2.3 分子標(biāo)記分析結(jié)果

在定位于第六同源群的PLUG、EST和SSR標(biāo)記中，最終篩選出1個(gè)PLUG特異標(biāo)記(TNAC1677)、3個(gè)EST特異標(biāo)記(BQ159615、CD454198、CD454353)和2個(gè)SSR特異標(biāo)記(Xwmc672、Xcwm532)(表1)，以上6個(gè)標(biāo)記均在濱麥和M13063A-1中擴(kuò)增出了明顯的特異性條帶(圖5)。TNAC1677、BQ159615、CD454198和CD454353位于小麥第六同源群染色體短臂，結(jié)合以華山新麥草基因組DNA為探針的GISH結(jié)果(圖2c)，說明M13063A-1攜帶的濱麥染色體片段為6NsS。

2.4 農(nóng)藝性狀和條銹病抗性

農(nóng)藝性狀鑒定結(jié)果(表2和圖6a、圖6b、圖6c)表明，M13063A-1的株高極顯著低于親本7182，穗長極顯著小于親本7182。在成株期，M13063A-1、7182和輝縣紅的條銹病抗性等級(jí)分別為1級(jí)、3級(jí)和4級(jí)(圖6d)，這表明M13063A-1在成株期抗條銹菌生理小種條中31和條中32。

a:以烏拉爾圖小麥基因組DNA(綠)、濱麥基因組DNA(綠)和粗山羊草基因組DNA(紅)為探針的多色GISH；b：分別以O(shè)ligo-pTa71-2(紅)、Oligo-119(紅)、Oligo-60(紅)和濱麥基因組DNA(綠)、Oligo-pSc119.2(綠)為探針的GISH(b1：Oligo-pTa71-2；b2：Oligo-119；b3：Oligo-60)；c：根據(jù)圖4 b1、b2、b3整理的B亞基因組染色體和易位染色體信號(hào)模式。白色箭頭指示易位染色體。T表示易位染色體。

表1 M13063A-1攜帶的濱麥6NsS連鎖的PLUG、EST和SSR標(biāo)記Table 1 PLUG,EST and SSR polymorphic markers mapped on Lm#6NsS in M13063A-1

M：D2000；1：7182；2：山農(nóng)20；3：L.mollis；4：M13063A-1；a1：TNAC1677-HaeⅢ；a2：TNAC1677-TaqⅠ；b1：BQ159615；b2：CD454198；b3：CD454353；b4：Xwmc672；b5：Xcwm532。箭頭指示特異條帶。

表2 M13063A-1及其親本7182的主要農(nóng)藝性狀比較Table 2 Agronomic traits of M13063A-1 and its parent 7182

a:植株；b：穗；c：小穗和籽粒；d：條銹病抗性；1：7182；2：濱麥；3：M13063A-1；4：輝縣紅。

3 討 論

3.1 附加易位系M13063A-1形成的原因

在二體異附加系M13063-3-3進(jìn)行減數(shù)分裂時(shí)，6B染色體和6Ns外源染色體發(fā)生同源重組是形成6BS·6NsS易位染色體的前提。由于部分同源性，一條6B染色體與一條6Ns外源染色體配對(duì)且發(fā)生易位，形成6BS·6NsS易位染色體和6BL·6NsL易位染色體，而另一條6B染色體和6Ns染色體不配對(duì)或者進(jìn)行配對(duì)但是不發(fā)生易位。在形成配子時(shí)，產(chǎn)生含有21條普通小麥染色體和一條6BS·6NsS易位染色體的雄配子和雌配子，雄配子和雌配子結(jié)合，形成含有42條普通小麥染色體和一對(duì)6BS·6NsS易位染色體的合子，進(jìn)而形成了附加易位系M13063A-1。

3.2 M13063A-1中的染色體結(jié)構(gòu)變異

Han等[13]在小麥-中間偃麥草衍生系Z4、Z5和Z6中發(fā)現(xiàn)復(fù)雜的易位和重組，這些結(jié)構(gòu)變異都是自發(fā)產(chǎn)生的，其中，Z5體細(xì)胞染色體數(shù)目為44條，在普通小麥基因組上附加了一對(duì)易位染色體，該易位包含A組、D組和中間偃麥草的染色體片段。M13063A-1和Z5的不同是其易位只涉及小麥B基因組染色體。這種附加易位系出現(xiàn)的原因尚不確定，有待進(jìn)一步探究。

在M13063A-1減數(shù)分裂中期Ⅰ細(xì)胞的GISH結(jié)果中，并未觀察到6BS·6NsS易位染色體和6B染色體形成的多價(jià)體,這與預(yù)期結(jié)果不符。(GAA)10[26](圖片未提供)和寡核苷酸探針Oligo-pTa535、Oligo-119、Oligo-60都未在易位染色體片段上產(chǎn)生信號(hào)，結(jié)合原位雜交結(jié)果，推測易位染色體片段是6BS上包含次縊痕的一小段片段，易位染色體不含有6B染色體的隨體和著絲粒，其著絲粒是濱麥6Ns著絲粒。端粒花束的形成和著絲粒配對(duì)在同源染色體的配對(duì)過程中起著至關(guān)重要的作用[27]，但是隨體是否在1B和6B染色體的同源配對(duì)過程中起作用尚不清楚。易位染色體不含有6B的著絲粒和隨體，這可能是M13063A-1在減數(shù)分裂中期Ⅰ沒有多價(jià)體形成的原因。

3.3 M13063A-1抗條銹病基因的來源

攜帶外源染色體的衍生材料是利用外源優(yōu)異基因的重要種質(zhì)資源。Bao等[1]和Li等[2]都曾在小麥-濱麥衍生系中定位到了來自濱麥的條銹病抗性基因。在本研究中，雖然M13063A-1抗條銹病，且其親本之一7182不抗病，但因缺少另一親本山農(nóng)20的條銹病抗性表現(xiàn)，所以無法確定M13063A-1的抗條銹病基因來源。因此，M13063A-1的條銹病抗性是否來源于濱麥有待進(jìn)一步鑒定。