李光宇，李田田，李洪連，臧 睿，徐 超，耿月華，張 猛

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南鄭州 450000)

麥根腐平臍蠕孢[Bipolarissorokiniana(Sacc.) Shoemaker]是一種可以引起禾谷類植物根腐病、葉斑病、斑枯病和籽粒黑點(diǎn)等病害的病原真菌[1-3]，其分布于世界上很多國(guó)家[4-5]。近年來(lái)，由于秸稈還田措施的實(shí)施、耕作制度的改變以及氣候的變化[6]，小麥根腐病的發(fā)生在中國(guó)不斷加重，尤其在黃淮地區(qū)，已經(jīng)成為了小麥生產(chǎn)上的重要問(wèn)題[7]。麥根腐平臍蠕孢在小麥的整個(gè)生育期內(nèi)均可侵染小麥導(dǎo)致病害，該菌在田間主要以菌絲體或分生孢子存活于帶菌種子、土壤或病殘?bào)w組織，其中分生孢子在病害侵染循環(huán)中起著重要作用[8]。在自然條件下，麥根腐平臍蠕孢主要以無(wú)性態(tài)分生孢子侵染為害。

研究證實(shí)，子囊菌交配型基因(mating type gene, MAT)具有一定的廣泛性，其編碼的產(chǎn)物是調(diào)控子囊菌有性生殖的重要轉(zhuǎn)錄因子[9]。子囊菌交配型基因?qū)φ婢纳郴虮磉_(dá)與調(diào)控具有重要意義。同宗配合子囊菌通常觸及單個(gè)遺傳座位，交配型基因的編碼產(chǎn)物具備轉(zhuǎn)錄因子的功效，主要調(diào)控真菌有性生殖相關(guān)的一系列生命過(guò)程。然而，對(duì)異宗配合子囊菌的有性階段研究更具挑戰(zhàn)性，旋孢腔菌屬(Cochliobolus)的大多數(shù)物種為異宗配合型。文景芝和陸家云[10]對(duì)中國(guó)17種植物上的B.sorokiniana進(jìn)行了有性孢子誘導(dǎo)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)子囊孢子的產(chǎn)生受培養(yǎng)基、溫度、pH值的影響。Zhong和 Brian[11]對(duì)麥根腐平臍蠕孢的交配型基因開(kāi)展了詳細(xì)的研究，發(fā)現(xiàn)C.sativus有兩個(gè)交配型基因，分別為MAT-1(2 681 bp)及MAT-2(2 547 bp)；將其與近似種B.maydis進(jìn)行同源比對(duì)并設(shè)計(jì)了針對(duì)B.sorokiniana的MAT-2基因HMG(high mobility group domain)的特異性引物，可特異性的擴(kuò)增270 bp的HMG片段。絕大多數(shù)半知菌的有性態(tài)屬于子囊菌門，尋找半知菌所對(duì)應(yīng)的有性態(tài)一直是真菌學(xué)研究的熱點(diǎn)。本研究擬對(duì)中國(guó)河南、安徽兩省小麥田分離到的33株麥根腐平臍蠕孢群體進(jìn)行MAT基因型探索，為該菌的遺傳學(xué)研究及病害生態(tài)防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株獲取

于2017-2019年在河南、安徽不同地區(qū)于小麥揚(yáng)花期采集小麥根部土壤(2～5 cm土層)及病葉標(biāo)本。土壤采集參考翟妮平[12]方法。土壤樣本采用稀釋平板法[13]、病葉通過(guò)組織分離方法[14]獲得目的菌株，分別挑取單個(gè)分生孢子進(jìn)行純化，共獲得麥根腐平臍蠕孢菌33株。

1.2 HMG片段的檢測(cè)

DNA提?。豪脽o(wú)菌打孔器(直徑5 mm)將分離菌株的單孢純培養(yǎng)物制成菌餅，放入PD(potato dextrose)液體培養(yǎng)基中，于25 ℃下震蕩(140 r·min-1)培養(yǎng)5 d；收集菌絲，加入液氮進(jìn)行冷凍干燥并磨碎，參照Z(yǔ)hong[15]的方法提取病菌基因組DNA。用Zhong[11]設(shè)計(jì)的引物CsPrimer1(5′-AAGGCTCCCCGCCCGATGAAC-3′；5′-CTCGGCGTGTACTTGTAGTTGGG-3′)和方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA模板濃度為5 ng·μL-1。取5.0 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，有擴(kuò)增條帶的為MAT-2基因，未擴(kuò)增出條帶的為MAT-1基因。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察和致病性測(cè)定

對(duì)分離獲得的33株麥根腐平臍蠕孢菌株參照Leng[16]的方法進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、顯微形態(tài)特征觀察，于產(chǎn)孢旺盛期制玻片、拍照，記錄產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征、孢子形態(tài)及大小，并進(jìn)行致病性測(cè)定。

1.4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

通過(guò)同源比對(duì)的方式在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的數(shù)據(jù)庫(kù)里選取含有MAT-2基因的子囊菌不同類群69個(gè)菌株，進(jìn)行MAT-2蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析，用貝葉斯法構(gòu)建MAT-2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)33株麥根腐平臍蠕孢菌進(jìn)行MAT基因PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，有21株檢測(cè)出目的條帶(圖1)，大小一致，均為270 bp左右，其中來(lái)自河南的有L1、L2、L3、L6b、L6w、L8、L11、L12、L13、L14、L17、L18、L19b、L19w、14，來(lái)自安徽的有1、2、3、4、6、15，均為MAT-2型菌株。其余12株無(wú)目的條帶，為MAT-1基因型菌株。群體基因型MAT-2∶MAT-1為7∶4。

2.2 菌落形態(tài)

挑選MAT-1基因型菌株(L4、L15、L16)和MAT-2基因型菌株(L1、L2、L6b)，在PDA平板上培養(yǎng)7 d后觀察其菌落形態(tài)(圖2)。發(fā)現(xiàn)菌落早期呈絨毛狀，稀疏，培養(yǎng)7 d后變成黑色或暗褐色，背面褐色。生長(zhǎng)較快，25 ℃下，7 d滿皿，菌落直徑達(dá)9 cm，呈輪紋狀，其中L6b最明顯。

表1 33個(gè)麥根腐平臍蠕孢菌株的采集信息Table 1 Sampling sites of the 33 Bipolaris sorokiniana strains

A(從左向右)： DL2000 marker、L1、L2、L3、L4、L6b、L6w、L8、L11、L12、L13、L14、L15、L16、L17、L18、L19b、L19w、1、2、3、4、5、6、7；B(從左向右)： DL2000 marker、8、9、11、12、14、15、16、17、21。

2.3 孢子形態(tài)

菌株L1和L2攜帶有MAT-2基因，菌株L4和L15攜帶有MAT-1基因。菌株L1和L2的分生孢子呈橢圓形，略彎(圖3)，菌株L4和L15的分生孢子呈梭形，均為暗橄欖褐色，所有菌株孢子長(zhǎng)度為60～80 μm(圖3)。各菌株的菌絲多表生，褐色，寬度為2.5～4.0 μm(圖4)。大多分生孢子梗單生，褐色。分生孢子棍棒形或長(zhǎng)橢圓形，黃褐色至深褐色，多直，有時(shí)彎，基部細(xì)胞近臍點(diǎn)處顏色較淺，5～8(多為7個(gè))個(gè)假隔膜，54.0～84.5 μm × 18.5～25.5 μm，av：67.5 μm× 22.0 μm。

2.4 致病性

將直徑為5 mm的菌餅接種到小麥葉片上，發(fā)現(xiàn)L1、L2、L6b(MAT-1基因型菌株)和L4、L15、L16(MAT-2基因型菌株)在小麥的接種部位均產(chǎn)生明顯的灰褐色病斑，說(shuō)明MAT-1或MAT-2交配基因型菌株均有強(qiáng)的致病性，二者在葉片上的擴(kuò)展程度無(wú)明顯差別，均是先引起葉片失綠變黃，然后出現(xiàn)壞死病斑，潮濕環(huán)境下病斑周邊長(zhǎng)出白色菌絲(圖5)。

圖3 4株麥根腐平臍蠕孢菌孢子形態(tài)Fig.3 Morphological observation of the conidia from the four strains of Bipolaris sorokiniana

圖4 4株麥根腐平臍蠕孢菌絲的形態(tài)Fig.4 Morphological observation of the hyphae from the four strains of Bipolaris sorokiniana

圖5 6株麥根腐平臍蠕孢菌株接種矮抗58葉片5 d的發(fā)病情況Fig.5 Aikang 58 leaves inoculated with the six strains of Bipolaris sorokiniana after 5 d

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析

用貝葉斯法構(gòu)建了69株子囊菌的MAT-2基因型的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6)，外群選擇Saccharomy cescerevisiae(登錄號(hào)：CAA45335)。進(jìn)化樹(shù)顯示，具有MAT-2基因型的子囊菌被分為6個(gè)亞組，分別為盤菌亞門Pezizomycotina的糞殼菌綱Sordariomycetes、散囊菌綱Eurotiomycetes、座囊菌綱Dothideomycetes、茶漬綱Lecanoromycetes、錘舌菌綱Leotiomycetes和酵母菌亞門Saccharomycotina的酵母綱 Saccharomycetes。該進(jìn)化樹(shù)與王雪亮等[17]MAT-1基因的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)非常類似，與所選物種的分類進(jìn)化關(guān)系很接近。典型的以瓶體產(chǎn)孢方式的青霉屬(Penicillium)和曲霉屬(Aspergillus)聚類在進(jìn)化樹(shù)的端部。而B(niǎo).sorokiniana與孔生式產(chǎn)孢的Alternaria、Stemphylium、Ulocladium、Curvlaria等屬的菌株聚類在一個(gè)亞組，與分類學(xué)的結(jié)果相一致。整體分析結(jié)果與物種的分子系統(tǒng)學(xué)表現(xiàn)出來(lái)的親緣關(guān)系基本一致。

3 討 論

絲孢真菌的有性態(tài)是真菌學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，大多數(shù)菌有性態(tài)為MAT基因交配型， MAT 基因的進(jìn)化與物種進(jìn)化一致。本研究中，MAT-1和MAT-2型菌株的菌落形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速度、孢子形態(tài)和致病性均無(wú)明顯差異。麥根腐平臍蠕孢菌的無(wú)性繁殖產(chǎn)孢方式與Bipolarismaydis的非常近似。Turgeon[18]對(duì)B.maydis的有性態(tài)的研究表明，兩種不同交配型菌株能夠穩(wěn)定的產(chǎn)生子囊孢子，但是文景芝[10]發(fā)現(xiàn)，麥根腐平臍蠕孢菌即使存在兩種交配型的孢子，也未必可以產(chǎn)生有成熟子囊孢子的子囊殼。本研究發(fā)現(xiàn)，河南、安徽小麥田的B.sorokiniana群體存在兩種交配型的菌株，但是目前還未在自然條件下發(fā)現(xiàn)其有性態(tài)。鑒于此，今后應(yīng)從兩個(gè)方面開(kāi)展下一步研究，一是在大田尋找麥根腐平臍蠕孢菌的有性態(tài)；二是在室內(nèi)用兩種交配型菌株進(jìn)行有性態(tài)的誘導(dǎo)，以探索異宗配合的子囊菌的有性孢子產(chǎn)生機(jī)制。

圖6 貝葉斯法構(gòu)建的69株 MAT-2交配型子囊菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of MAT-2 mating genes in 69 ascomyces constructed by bayesian method

麥根腐平臍蠕孢菌是在世界范圍內(nèi)影響小麥生產(chǎn)的一種重要病原菌。子囊菌交配型基因MAT是調(diào)控子囊菌有性生殖的重要的轉(zhuǎn)錄因子。本研究發(fā)現(xiàn)，在河南、安徽地區(qū)的麥根腐平臍蠕孢中存在MAT-1和MAT-2兩種交配型基因，并且兩種交配型菌株在其生物學(xué)性狀和致病性上無(wú)明顯差異。本研究結(jié)果有助于深入開(kāi)展麥根腐平臍蠕孢菌的有性生殖的研究和應(yīng)用，并且為其他的子囊菌交配型基因的研究提供的理論依據(jù)。