MST1通過促進(jìn)PEPCK的表達(dá)調(diào)控小鼠肝臟糖異生

解相宏，耿 超，趙 微，李春美，張偉虹，楊佳卉，劉曉軍*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100005；2.山西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室, 山西 太原 030001)

糖尿病是一種代謝紊亂性疾病，該病憑借著高患病率、高致殘率和高致死率已然成為全球面臨的嚴(yán)重健康問題。近年來, 中國的糖尿病發(fā)病率逐年升高，發(fā)病人數(shù)亦逐年增加。有研究表明，按照世界衛(wèi)生組織(WHO)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，中國成年人的糖尿病總患病率從2007年的9.7%已上升到2017年的11.2%[1]。肝臟作為代謝的中樞器官，是機(jī)體進(jìn)行糖異生的主要場(chǎng)所。在糖尿病進(jìn)程中，肝臟糖輸出異常增加是造成糖尿病患者持續(xù)性高血糖的重要因素之一[2]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)是肝臟糖異生途徑的一個(gè)限速酶，有文獻(xiàn)報(bào)道糖尿病db/db小鼠在感染PEPCKshRNA腺病毒后，極大改善了小鼠的高血糖和高胰島素血癥等不良狀況[3]。哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶1 (mammalian sterile 20-like kinase 1, MST1) 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，作為Hippo信號(hào)通路的核心成分之一，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長等生物過程[4-6]。有研究表明，MST1可以通過沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP-1c)，提高抗氧化基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控肝臟的脂代謝[7]。然而，有關(guān)MST1在肝臟糖異生中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周齡的雄性糖尿病模型db/db小鼠和對(duì)照db/m小鼠[SPF級(jí)，南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0008]；8周齡的雄性C57BL/6小鼠(SPF級(jí)，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)：人肝癌細(xì)胞系(HepG2)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 質(zhì)粒和腺病毒：MST1表達(dá)質(zhì)粒(pCMV5-MST1-FLAG)、MST1失活突變體表達(dá)質(zhì)粒(pCMV5-DN-MST1-FLAG)(中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的袁增強(qiáng)教授友情提供)；報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-PEPCK啟動(dòng)子(-450 bp～-1 bp)，pRL-TK質(zhì)粒、FOXO1表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3-FOXO1-FLAG)、FOXO1突變體表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3-FOXO1-Δ256-FLAG)、MST1過表達(dá)腺病毒(Ad-MST1)、帶GFP標(biāo)簽的腺病毒(Ad-GFP)、FOXO1干擾腺病毒(Ad-shFOXO1)、對(duì)照干擾腺病毒(Ad-shCON)(本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.1.4 主要試劑：Trizol(Invitrogen公司)；RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清(Gibco公司)；SYBR Green Ⅰ Q-PCR kit(Promega公司)；組織細(xì)胞葡萄糖氧化酶測(cè)定試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)；PierceTMBCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific公司)；高效真核轉(zhuǎn)染試劑VigoFect(威格拉斯生物技術(shù)有限公司)；Dual-Luciferase?Reporter Assay System(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和RT-qPCR：剪取適當(dāng)大小的小鼠肝臟組織在低溫研磨后用Trizol試劑提取總RNA。定量取2 μg的總RNA配置20 μL反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。定量取1 μL的cDNA模板，采用SYBR Green I Q-PCR kit配置20 μL反應(yīng)體系，在Bio-Rad CFX96 real-time system上進(jìn)行擴(kuò)增并實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。所有基因的表達(dá)都以β-actin進(jìn)行均一化處理，最終得到mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：人MST1上游引物：5′-CGGAATACAGTGATAGGAAC-3′，下游引物：5′-AAGATTGCCC TCATTGGATG-3′；鼠MST1上游引物：5′-AGGAATACAGTAATAGG GAC-3′，下游引物：5′-AATATTGCCCTCATTGGATG-3′； 人PEPCK上游引物：5′-TATGACAACTGCTGG TTGGC-3′，下游引物：5′-ATAACCGTCTTGCTTTCG ATC-3′；鼠PEPCK上游引物：5′-CAGGATCGAAA GCAAGACAGT-3′，下游引物：5′-AAGTCCTCTTCC GACATCCAG-3′；鼠FOXO1上游引物：5′-GTGAAC ACCATGCCTCACAC-3′，下游引物：5′-CACAGTCC AAGCGCTCAATA-3′；β-actin上游引物：5′-CCAGC CTTCCTTCTTGGGTAT-3′，下游引物：5′-TGCTGG AAGGTGGACAGTGAG-3′；人GAPDH上游引物：5′-CCCCTTCATTGACCTCAACTAC-3′，下游引物：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAAAG-3′；擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，循環(huán)55次；95 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s。結(jié)果以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2 細(xì)胞感染病毒和轉(zhuǎn)染：分離C57BL/6小鼠的肝原代細(xì)胞接種至6孔板，培養(yǎng)12 h之后感染Ad-MST1，以Ad-GFP作為對(duì)照，感染24～48 h后收集細(xì)胞。小鼠肝原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)以及感染腺病毒具體方法見參考文獻(xiàn)[8]。將HepG2細(xì)胞以(2～4)×104個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別設(shè)兩組各3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染pCMV5-MST1-FLAG質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染方式參照高效真核轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。

1.2.3 細(xì)胞葡萄糖輸出的測(cè)定：C57BL/6小鼠的肝原代細(xì)胞在感染病毒48 h后，棄去培養(yǎng)基并用PBS洗3遍，然后換成無葡萄糖無酚紅的DMEM培養(yǎng)基，加入乳酸鈉、丙酮酸鈉、地塞米松(DEX)和forskolin(FSK)至終濃度分別為20 mmol/L及2 mmol/L和1 μmol/L及10 μmol/L，37 ℃孵育3～6 h。收集上清液測(cè)定葡萄糖的濃度(具體操作見試劑盒說明書)。收集細(xì)胞用RIPA裂解液裂解后，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，以葡萄糖濃度和蛋白濃度的比值作均一化(具體操作見試劑盒說明書)。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)啟動(dòng)子活性：在條件為37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞至匯合度為50%～70%時(shí)，將不同的質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入細(xì)胞，培養(yǎng)24～48 h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定各組熒光素酶活性，以對(duì)照組作均一化處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR檢測(cè)MST1在糖尿病小鼠db/db肝臟組織中的表達(dá)

糖尿病db/db小鼠肝臟組織中，MST1 mRNA的表達(dá)水平(2.42±0.52)顯著高于對(duì)照組(1.00±0.41)(P<0.001)。

2.2 肝原代細(xì)胞中過表達(dá)MST1促進(jìn)葡萄糖輸出

小鼠肝原代細(xì)胞感染MST1腺病毒，Ad-MST1組的葡萄糖輸出(1.40±0.61)高于對(duì)照組(1.00±0.14)(P<0.05)。

2.3 MST1通過增強(qiáng)PEPCK的啟動(dòng)子活性來促進(jìn)其表達(dá)

在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)MST1，可顯著上調(diào)PEPCK的mRNA水平(P<0.001)(圖1A)；同時(shí)增強(qiáng)了PEPCK的啟動(dòng)子活性(P<0.01)，而MST1失活突變體(DN-MST1)對(duì)PEPCK啟動(dòng)子激活作用消失，表明MST1可以通過增加PEPCK啟動(dòng)子活性來促進(jìn)其表達(dá)(圖1B)。

A.MST1 over-expression upregulated the mRNA levels of PEPCK; B.MST1 over-expression increased the activity of PEPCK promoter; *P<0.01，**P<0.001 compared with control group

2.4 FOXO1參與MST1調(diào)控PEPCK

在HepG2細(xì)胞中，過表達(dá)叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O1(forkhead transcription factor O1, FOXO1)顯著激活PEPCK的啟動(dòng)子活性(P<0.05)，而突變體FOXO1-Δ256不僅對(duì)PEPCK啟動(dòng)子活性無激活效應(yīng)，反而有抑制作用(P<0.001)；共轉(zhuǎn)染MST1拮抗了FOXO1-Δ256對(duì)PEPCK啟動(dòng)子活性的抑制作用(P<0.001)(圖2A)。進(jìn)一步在肝原代細(xì)胞中，用Ad-shFOXO1敲低FOXO1表達(dá)，MST1誘導(dǎo)PEPCKmRNA表達(dá)增加的作用消失(圖2B)。

A.MST1 over-expression alleviated the inhibitory effect of FOXO1-Δ256 on the activity of PEPCK promoter; B.FOXO1 mediated MST1-induced increase in PEPCK mRNA levels; *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with control group；#P<0.001 compared with FOXO1-Δ256

3 討論

在長期禁食情況下，機(jī)體會(huì)啟動(dòng)肝臟糖異生增加糖輸出來維持血糖水平，保證其相對(duì)恒定的穩(wěn)態(tài)，這是一個(gè)多分子、多因素參與和調(diào)控的過程。但在某些異常機(jī)制下，肝糖異生過度激活使內(nèi)源性血糖水平升高最終導(dǎo)致糖尿病等代謝類疾病的發(fā)生[9]。

MST1是一種促凋亡激酶，是細(xì)胞凋亡過程的重要調(diào)控者。本研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病模型db/db小鼠肝臟組織中MST1的mRNA 表達(dá)增加，過表達(dá)MST1促進(jìn)小鼠肝原代細(xì)胞的葡萄糖輸出。之前有研究證實(shí)在糖尿病小鼠模型中敲除MST1有抑制高血糖和糖尿病進(jìn)展的保護(hù)性作用[10]，表明MST1可能參與機(jī)體的葡萄糖代謝。PEPCK是肝糖異生途徑中一個(gè)非常關(guān)鍵的限速酶，已有報(bào)道表明FOXO1、CREB、 PGC-1α與激素和糖異生限速酶葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)和PEPCK編碼基因的串話(cross talk)是決定糖異生啟動(dòng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。本研究中，MST1促進(jìn)了PEPCKmRNA水平的表達(dá)并增強(qiáng)PEPCK的啟動(dòng)子活性，表明MST1可能通過調(diào)節(jié)PEPCK的表達(dá)在肝臟糖異生過程中發(fā)揮作用。FOXO1屬于FOXOs家族的一個(gè)亞型，是胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)，可以調(diào)控機(jī)體多種基因的表達(dá)，包括可以通過上調(diào)PEPCK的表達(dá)參與機(jī)體糖代謝。有報(bào)道稱肝臟中FOXO蛋白功能的調(diào)節(jié)對(duì)胰島素維持糖穩(wěn)態(tài)和抑制肝臟葡萄糖生成的能力至關(guān)重要，而FOXO蛋白功能失調(diào)被認(rèn)為是糖尿病的發(fā)病機(jī)制之一[12]。MST1可以通過磷酸化FOXO1促進(jìn)FOXO1入核發(fā)揮一系列生理病理功能[5]。本研究中，過表達(dá)MST1逆轉(zhuǎn)了FOXO1突變體對(duì)PEPCK啟動(dòng)子活性的抑制效應(yīng)，而敲低FOXO1表達(dá)后，MST1對(duì)PEPCKmRNA的促表達(dá)作用消失。

綜上所述，MST1可以通過促進(jìn)PEPCK的表達(dá)來調(diào)控小鼠肝臟糖異生，并且這一過程依賴于FOXO1。本研究表明MST1有可能成為未來糖尿病預(yù)防和臨床診療的新靶點(diǎn)。