范美玲，應苗法，趙蕊，金燁成，李明星

浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院藥劑科，杭州 310016

纖維化是許多慢性炎性疾病的最終病理結(jié)果，其主要病理特征是炎癥或受損組織周圍的纖維結(jié)締組織過度聚積，引起細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中的膠原蛋白及纖連蛋白過度增加，成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，導致永久性瘢痕、器官衰竭甚至死亡[1-3]。臨床上常見的纖維化疾病包括肺、肝、心肌、腎、骨髓纖維化及硬化病等[4-5]，盡管不同纖維化疾病的發(fā)病原因和臨床表現(xiàn)各不相同，但其最終的致病機制是一致的。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是纖維化疾病發(fā)生的重要調(diào)控因子，能夠調(diào)控成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，通過與下游細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子Smads作用，誘導膠原的合成[6-7]。因此，深入研究TGF-β在纖維化疾病中的作用及其調(diào)控機制，對纖維化疾病的治療尤為重要。本文將對TGF-β信號通路在纖維化疾病發(fā)生機制中的研究進展進行綜述，以期為新的靶向藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 TGF-β信號通路的特征及作用機制

1.1 TGF-β信號通路的特征

1.1.1 TGF-β的組成 TGF-β屬于細胞因子超家族，后者由TGF-β、活化素、抑制素、生長和分化因子(growth and differentiation factors，GDF)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)等組成，主要分成TGF-β-活化素亞家族和BMP亞家族。TGF-β具有二聚體結(jié)構(gòu)，在所有細胞中均表達，在調(diào)控細胞的生長、遷移、免疫抑制、內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換及ECM重構(gòu)等方面具有重要作用[8]。已發(fā)現(xiàn)的TGF-β有5個亞型，即TGF-β1－TGF-β5；然而，在哺乳動物中，TGF-β僅包含3個亞型，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，各亞型在調(diào)控生物功能過程中的作用相似，其中TGF-β1在各組織中的表達水平最高，活性最強，廣泛參與胚胎發(fā)育、組織纖維化及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生理病理過程。

圖1 TGF-β信號通路的作用機制Fig.1 The mechanisms of TGF-β signaling pathway

1.1.2 TGF-β受體的分類及信號傳遞 TGF-β受體包含3個亞家族，即Ⅰ型受體(type Ⅰ TGF-β receptor，TβR-Ⅰ)、Ⅱ型受體(TβR-Ⅱ)及Ⅲ型受體(TβR-Ⅲ)，其受體與配體具有類似的生物活性，均參與調(diào)控細胞的增殖、分化及凋亡等過程[9]。有研究證實，TβR-Ⅰ不能單獨與TGF-β結(jié)合發(fā)揮作用，需要TβR-Ⅱ共同參與，而TβR-Ⅱ可直接與TGF-β1結(jié)合；TβR-Ⅲ與TGF-β1具有較高的親和性，其主要功能是將TGF-β傳遞至受體分子，與其他兩個受體共同參與信號的傳遞[10]。Smads蛋白是TGF-β下游的信號蛋白，能夠?qū)GF-β信號從細胞外傳遞至細胞核發(fā)揮生物學功能。根據(jù)其結(jié)構(gòu)及功能，Smads蛋白可分為3種不同的亞型：受體調(diào)節(jié)型Smads蛋白(包括Smad1/2/3/5/8)、共同調(diào)節(jié)型Smads蛋白(Smad4)及抑制型Smads蛋白(包括Smad6及Smad7)；其中Smad2及Smad3參與了TGF-β信號的傳遞，Smad1/5/8參與了BMP信號的傳遞[11]。

1.2 TGF-β信號通路的作用機制 TGF-β信號通路主要分為經(jīng)典的TGF-β/Smads信號通路和非經(jīng)典的TGF-β信號通路，其信號通路作用的過程如圖1所示，具體的作用機制如下。

1.2.1 經(jīng)典的TGF-β/Smads信號通路 正常情況下，TGF-β主要存在于ECM中，處于失活狀態(tài)。在經(jīng)典的TGF-β/Smad信號傳遞過程中，配體先與TβR-Ⅱ結(jié)合，并將TβR-Ⅰ、TβR-Ⅲ招募至ECM，磷酸化TβR-Ⅰ并與其結(jié)合，形成TβR-Ⅰ-TGF-β-TβR-Ⅱ-TβR-Ⅲ四聚體；磷酸化的TβR-Ⅰ將Smad2及Smad3在絲氨酸殘基的C末端磷酸化，招募Smad4并與其形成復合物，轉(zhuǎn)移至細胞核，調(diào)控TGF-β靶基因的轉(zhuǎn)錄[12]。此外，抑制型Smad7可被招募至TGF-β受體或Smad2/3的復合物中，通過Smad特異性E3連接酶啟動其降解，抑制TGF-β的信號轉(zhuǎn)導。

1.2.2 非經(jīng)典的TGF-β信號通路 除了Smads介導的典型TGF-β信號通路外，TGF-β受體還可以通過信號轉(zhuǎn)導中間體的磷酸化或與其直接相互作用來激活其他細胞內(nèi)通路，如磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinases/protein kinase B，PI3K/AKT)通路、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)及RhoA/Rho激酶(RhoA/Rho kinase，RhoA/Rock)信號通路等，被稱為非經(jīng)典的TGF-β信號通路[13]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β與TβR-Ⅰ及TβR-Ⅱ結(jié)合后，通過與PI3K亞基p85作用活化PI3K/AKT通路，然后AKT活化下游的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程；此外，TGF-β活化后可激活下游的ERK、p38MAPK/JNK及Rock信號通路，參與調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡及內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]。

2 TGF-β信號通路在纖維化疾病發(fā)生中的作用機制

2.1 肺纖維化 肺纖維化是由各種致病因素引起的一種復雜的間質(zhì)性肺病，臨床表現(xiàn)為肺組織中存在瘢痕，肺泡壁增厚，可使血氧交換減少，多數(shù)患者因肺衰竭發(fā)生窒息性死亡[15]。目前認為，導致肺纖維化發(fā)生的原因包括環(huán)境因素、放射治療、藥物因素及自身免疫性低等。肺組織損傷與修復的異常是肺纖維化形成的主要過程，其病理機制是肺血管內(nèi)皮細胞及肺泡上皮細胞受到致病因子損傷后，引起肺泡炎癥及肺泡反復性損傷，成纖維細胞異常增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，膠原蛋白表達增加，ECM大量聚積，進而引起肺組織進行性瘢痕形成，最終導致肺纖維化病變[16]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β是促纖維化發(fā)生的主要細胞因子，肺組織中的多種細胞如巨噬細胞、中性粒細胞、肺泡上皮細胞、肌成纖維細胞等均可分泌TGF-β；TGF-β信號通路參與了肺纖維化的發(fā)生及發(fā)展[17]。

肺纖維化的形成過程涉及經(jīng)典的TGF-β/Smads信號通路及非經(jīng)典的TGF-β信號通路。體外研究發(fā)現(xiàn)，博來霉素及二氧化硅均可通過活化TGF-β1/Smads信號通路而誘導肺纖維化的形成；安洛替尼及米諾地爾均可抑制博來霉素誘導的TGF-β1/Smad3信號通路活化，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及成纖維細胞的增殖，增加細胞凋亡；丹參酮ⅡA可抑制二氧化硅誘導的TGF-β1/Smad3信號通路活化，上調(diào)Smad7的表達，改善肺纖維化[18-20]。另有研究發(fā)現(xiàn)，輻射能夠誘導TGF-β1的表達，增加膠原蛋白的沉積，誘發(fā)肺纖維化；異甘草酸鎂可抑制TGF-β1的升高，抑制下游的p38MAPK/AKT/Nox4通路，抑制成纖維細胞的分化，減輕肺纖維化[21]。目前肺纖維化尚無療效確切的治療藥物，已上市的吡非尼酮(pirfenidone)能夠靶向TGF-β，發(fā)揮抗肺纖維化的作用，減緩疾病的進展并延長患者的生存時間。深入探究TGF-β信號通路在肺纖維化發(fā)生過程中的作用，可為肺纖維化靶向治療藥物的研發(fā)提供新的 方向。

2.2 肝纖維化 肝纖維化是一種因機體對各種肝臟損傷修復異常引起的慢性肝臟疾病，并非單一性疾病，多種致病因素如病毒感染、乙醇及藥物損傷、脂肪肝、自身免疫性疾病等均會引起肝纖維化，并可進一步發(fā)展成肝硬化、肝癌。其主要的病理機制是ECM合成增多，并過量聚積；肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化并分化為肌成纖維細胞。有研究發(fā)現(xiàn)，多種信號通路參與了肝纖維化的發(fā)生，其中在正常肝組織中表達較低而在肝組織受損時被激活且表達增加的TGF-β被認為是肝纖維化發(fā)生的關鍵因子[22]。在正常的肝組織中，HSC處于非增殖的靜止狀態(tài)；急性或慢性肝損傷后，ECM中的TGF-β被激活并高表達，從而誘導HSC活化，并向增殖、遷移表型轉(zhuǎn)化，促進膠原及ECM蛋白的合成[23]。因此，TGF-β信號參與了HSC活化及膠原的合成，從而調(diào)控肝纖維化的進程。

TGF-β1的表達與ECM的聚積相關，在肝纖維化的發(fā)生中具有重要作用；Smad3及Smad4是TGF-β1下游的促纖維化基因，Smad2及Smad7可抑制纖維化的發(fā)生，敲除Smad3可抑制Ⅰ型膠原蛋白的表達及上皮-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化；Smad4可增強Smad3響應性啟動子活性，促進纖維化形成，而Smad7則可負向調(diào)控Smad3誘導的纖維形成[24]。在肝纖維化大鼠模型中，TGF-β/Smad/MAPK信號通路被激活，羥基脯氨酸水平及α-肌動蛋白表達均上調(diào)，膠原蛋白合成增加，厚樸酚可抑制TGF-β/Smad/MAPK信號通路的活化，有效逆轉(zhuǎn)肝損傷指標的改變；酪氨酸激酶抑制劑尼洛替尼可降低TGF-β1水平，抑制炎性因子的釋放，抑制四氯化碳誘導的肝纖維化，發(fā)揮潛在的抗纖維化作用[25]。此外，在人源及鼠源纖維化肝組織中，雙加氧酶Tet家族蛋白Tet3表達增加，促進TGF-β1的表達上調(diào)，誘導HSC轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞，抑制Tet3/TGF-β1信號通路可減輕小鼠肝纖維化[26]。因此，深入研究TGF-β/Smad信號通路上下游的調(diào)控機制有助于更好地設計TGF-β靶向抗肝纖維化藥物，但由于TGF-β的生物學功能廣泛，目前發(fā)現(xiàn)的靶向藥物不良反應顯著，已超出了治療獲益。

2.3 心肌纖維化 心肌纖維化是指各種致病因素引起的心肌成纖維細胞異常增殖，膠原蛋白合成增加，ECM過度生成及沉積，心臟間質(zhì)重構(gòu)的病理過程[27]。心肌纖維化的發(fā)病機制較復雜[28]，目前研究認為TGF-β信號通路活化、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase，TIMPs)表達失衡、自噬等參與了心肌纖維化的形成[29]。在心肌細胞中，心肌成纖維細胞約占90%；當心肌成纖維細胞處于靜息狀態(tài)時，分泌的MMPs能夠降解ECM，而TIMPs可抑制MMPs的活性，MMPs/TIMPs處于動態(tài)平衡；當成纖維細胞受到刺激后可異常增殖，并分化為肌成纖維細胞，使Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白合成增加，其中，Ⅰ型膠原蛋白主要控制心肌壁的拉伸強度，Ⅲ型膠原蛋白控制心肌的彈性，Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比例失衡可導致心肌纖維化的發(fā)生[30]。目前研究發(fā)現(xiàn)，促纖維生成因子TGF-β在心肌成纖維細胞的增殖、凋亡、分化等過程中發(fā)揮重要作用，TGF-β/Smad2/3信號通路參與了心肌纖維化的發(fā)生[31]。

在壓力負荷誘導的心肌纖維化小鼠模型中，TGF-β受體TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ表達上調(diào)，活化了下游的纖維化特異蛋白Smad2/3，從而促進心肌成纖維細胞的分化；敲除TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ或Smad2/3可抑制成纖維細胞的活性，減少ECM相關基因的表達，減輕心肌纖維化并改善心肌細胞的穩(wěn)態(tài)[32]。另外，在高血壓伴心肌纖維化大鼠模型中，TGF-β1/Smad2信號通路被激活，參與了心肌纖維化的發(fā)生，而淫羊藿苷Ⅱ可逆轉(zhuǎn)該過程[33]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，非經(jīng)典的TGF-β信號通路也參與了心肌纖維化的發(fā)生；TGF-β活化Wnt/β-catenin信號通路，進而穩(wěn)定TGF-β/Smad信號通路的活性，TGF-β也可活化下游的p38MAPK、ERK、JNKs等信號分子，調(diào)控心肌纖維化的發(fā)生[34]。有研究發(fā)現(xiàn)，心臟瓣膜纖維化患者的血清TGF-β1表達升高，瓣膜組織中Ⅰ型膠原蛋白及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達均升高，p38MAPK、JNK、ERK的表達上調(diào)，且TGF-β1的表達與JNK及p38 MAPK的磷酸化呈正相關[35]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在機械應力損傷小鼠心肌纖維化模型中，辣椒素受體4通過活化TGF-β1/Rho/Rock信號通路調(diào)控纖維化基因啟動子的活性及成纖維細胞的分化，敲除辣椒素受體4基因可發(fā)揮心肌保護作用[36]。因此，經(jīng)典的及非經(jīng)典的TGF-β信號通路均參與了心肌纖維化的發(fā)生過程，但由于其作用機制較復雜，目前仍未完全闡明。

2.4 腎纖維化 腎纖維化是許多慢性腎病發(fā)展的必經(jīng)階段，是慢性腎衰竭的最終表現(xiàn)，其主要特征是腎小管間質(zhì)纖維化、炎性細胞浸潤、腎小球硬化及腎實質(zhì)喪失。目前認為，腎纖維化的病理機制包括炎性細胞浸潤、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、成纖維細胞活化、Ⅲ型膠原及纖連蛋白合成增加、ECM過度沉積及腎小管周圍微血管堵塞，其中ECM過度沉積是腎纖維化發(fā)生的關鍵因素[37]。長期研究證實，TGF-β1是腎纖維化發(fā)生的關鍵調(diào)控因子，可通過激活下游的Smads信號通路誘導腎瘢痕的形成；機體中潛在儲存的TGF-β1具有抗炎及抑制腎纖維化發(fā)生的作用，而過度活化的TGF-β1則可造成進行性腎損傷[38]。在TGF-β/Smads信號通路中，Smad3具有致病性，Smad2及Smad7具有腎臟保護作用；腎臟損傷時，Smad2及Smad3高度活化，Smad7被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解；Smad4不僅能夠加重Smad3誘導的腎纖維化，還能通過增強Smad7的活性而抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)誘導的腎臟炎癥反應[39]。因此，通過Smad7或Smad3依賴的miRNA基因轉(zhuǎn)錄靶向TGF-β/Smad3信號通路可為腎纖維化的治療提供新的策略。

研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β超家族中的新型分子lefty-1能夠抑制TGF-β信號通路的活化，減少上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；過表達lefty-1可明顯抑制TGF-β1/Smad信號通路的活化，減少上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及ECM的合成，減輕腎臟間質(zhì)纖維化[40]。在糖尿病誘導的腎纖維化小鼠中，纖維生長因子21能夠抑制TGF-β/Smad2/3的激活，從而抑制Smad2/3向細胞核轉(zhuǎn)移，減少腎上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減輕糖尿病誘導的腎纖維化；進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除Smad3可減少Ⅰ型膠原及Ⅳ型膠原蛋白的沉積，抑制腎纖維化的進展[41-42]。

非經(jīng)典的TGF-β信號通路也參與了腎纖維化的發(fā)生。在阻塞性腎病小鼠的腎組織中，TGF-β1表達上調(diào)，激活下游的Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路，增加Ⅰ型膠原及纖連蛋白的沉積[42]。五倍子酸鹽能夠抑制腎細胞中TGF-β1/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)/β-catenin信號通路，從而抑制TGF-β1誘導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減輕腎纖維化[43]。此外，靈芝酸能夠抑制TGF-β/Smad及MAPK信號通路，從而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及纖連蛋白的表達，減少ECM的沉積，抑制腎纖維化進程[44]。

2.5 骨髓纖維化 骨髓纖維化是由于促纖維生長因子過度釋放，骨髓造血組織被結(jié)締組織取代所引起的骨髓增殖性疾病，包括原發(fā)性骨髓纖維化和繼發(fā)性骨髓纖維化，其病理特征主要為骨髓纖維化、貧血、血管增生、肝脾腫大及ECM增多[45]。研究發(fā)現(xiàn)，促炎細胞因子TGF-β在骨髓纖維化的發(fā)生中起重要作用，在促進骨髓纖維化及骨髓增生中起雙重作用[46]。在原發(fā)性骨髓纖維化患者的骨髓組織中，可檢測到骨髓纖維化發(fā)生前期TGF-β1的表達增加，從而誘導血管生成及纖維化的發(fā)生，且TGF-β1的表達與微血管密度、纖維化程度呈正相關[47]。

研究發(fā)現(xiàn)，在骨髓纖維化發(fā)生過程中，TβR-Ⅰ、 TβR-Ⅱ表達水平降低，Smad1、Smad2及Smad4的表達減少，經(jīng)典的TGF-β/Smads信號通路失活，非經(jīng)典的TGF-β信號通路參與了骨髓纖維化的發(fā)生[48]。 在骨髓纖維化患者的骨髓及脾臟中，非經(jīng)典的TGF-β1信號通路活化，激活下游的Hedgehog信號及p53信號，從而導致成骨細胞的分化及造血功能失調(diào)[49]。 另有研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性骨髓纖維化CD34+細胞中，TGF-β1上調(diào)下游分子miR-382-5p的表達，降低超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)的活性，導致活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的積聚，引起氧化應激及炎癥反應；抑制TGF-β1/miR-382-5p/SOD2的信號轉(zhuǎn)導可恢復SOD2的活性，減少ROS的生成，減輕骨髓纖維化[50]。

2.6 胰腺纖維化 胰腺纖維化是一種消化系統(tǒng)疾病，是慢性胰腺炎的典型病理表現(xiàn)；其病理機制是胰腺星狀細胞活化，ECM合成增加、降解減少導致了ECM聚積[51]。已有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1是胰腺纖維化發(fā)生過程中的主要調(diào)控因子，TGF-β信號轉(zhuǎn)導參與了胰腺相關疾病的調(diào)控，在細胞凋亡、炎癥反應及致癌作用等方面發(fā)揮重要作用[52]。

在大鼠胰腺星狀細胞中，TGF-β/Smad2/3信號通路參與了胰腺纖維化的形成，而香豆素二甲醚能夠抑制TGF-β/Smad2/3信號通路的活化，上調(diào)Smad7的表達，從而抑制星狀細胞的增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減輕氧化應激反應及纖維化的進展[53]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，慢性胰腺炎小鼠胰腺組織中TGF-β的分泌增加；在胰腺星狀細胞中，TGF-β激活下游的Smad2/3，上調(diào)膠原蛋白、纖連蛋白1及α-肌動蛋白的表達；胡椒堿能夠抑制TGF-β/Smad2/3信號通路的活化，降低纖維調(diào)控因子的表達，改善胰腺纖維化[54]。此外，TGF-β1也能激活下游的RhoA/Rock信號通路，增加Ⅰ型膠原蛋白及纖維狀肌動蛋白的表達，誘導胰腺纖維化；而內(nèi)皮抑制素能夠抑制TGF-β1/RhoA/Rock信號通路的活化，從而抑制TGF-β1誘導的胰腺纖維化[55]。由此可知，經(jīng)典的TGF-β/Smad信號通路和非經(jīng)典的TGF-β信號通路均可參與胰腺纖維化的發(fā)生。

綜上所述，TGF-β信號通路參與了肺、肝、心肌、腎臟及胰腺等纖維化疾病的發(fā)生，抑制經(jīng)典的TGF-β/Smads信號通路及非經(jīng)典的TGF-β信號通路的信號傳遞，對纖維化疾病具有潛在的治療作用。由于不同器官在結(jié)構(gòu)及功能上的差異，TGF-β信號通路對各纖維化疾病的調(diào)控機制也不完全相同，但仍有相似之處，如調(diào)控纖維化相關細胞的活化、膠原的合成及ECM的聚積。臨床上針對TGF-β及其上游信號分子的藥物研發(fā)為纖維化疾病的治療帶來了希望，已研發(fā)的靶向治療藥物包括吡非尼酮(pirfenidone)、尼達尼布(nintedanib)、TGF-β單克隆抗體(FG-3019、LY2382770)、干擾素-γ及維A酸等。由于TGF-β生物活性高且應用廣泛，已有的藥物很難對其進行單一調(diào)控，且對其他臟器的不良反應較大。目前，靶向經(jīng)典的TGF-β信號通路下游的信號分子Smad3、Smad7及非經(jīng)典的TGF-β信號通路成為新的研究方向，而篩選出纖維化發(fā)生相關的靶點，可為纖維化疾病治療藥物的研發(fā)提供理論 支持。