盧英

山東齊都藥業(yè)有限公司 山東臨淄 255400

1 材料與方法

1.1 材料

某化驗(yàn)室藥廠，截至2018 年11 月31 日使用了不同時(shí)間的新風(fēng)系統(tǒng)中的超細(xì)玻璃纖維空氣濾膜，分為3 個(gè)樣本組，每個(gè)樣本組含有3 個(gè)重復(fù)樣本（表1）。所有樣本裝入無菌采樣袋中，在4℃條件下運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，4h 內(nèi)處理。

表1 不同使用時(shí)間的空氣濾膜樣本編號(hào)

1.2 樣本處理

①每個(gè)樣本取15-20 片空氣濾膜剪碎，分裝入含有0.9% 生理鹽水的50mL 無菌離心管中，40C，200g 離心2h；②輕輕渦旋，用0.22μmMCE 微孔濾膜過濾；③收集微孔濾膜，剪碎后用于提取樣本的宏基因組DNA[1]。

1.3 16SrDNA 擴(kuò)增子測(cè)序

各樣本的宏基因組DNA 用無菌水稀釋至終濃度1ng/μL， 并 以此為模板， 利用16SV3-V4 區(qū) 通 用 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收后， 使用IonPlusFragmentLibraryKit48rxns 建庫試劑盒構(gòu)建宏基因組文庫，經(jīng)過定量和檢測(cè)后進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序方法為單端測(cè)序法。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

使用Cutadaptv1.9.1 先對(duì)reads 進(jìn)行初步處理得到原始數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行去除嵌合體序列的處理，得到有效數(shù)據(jù)。利用Uparsev7.0.1001 對(duì)所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97% 的一致性將序列聚類成為操作分類單元，同時(shí)會(huì)選取OTU 的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選OTU 中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為代表序列；對(duì)OTU 序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur 方法與SILVA132 的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析，獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

16SrDNA 擴(kuò)增子測(cè)序得到的有效數(shù)據(jù)數(shù)目在45878-64178范圍內(nèi)，平均長度395-415nt，有效數(shù)據(jù)中堿基質(zhì)量值大于20 的堿基所占的百分比超過82%，數(shù)據(jù)得率90% 以上[2]。

2.2 OTLs 聚類分析

在97% 相似性水平上進(jìn)行聚類，3 個(gè)樣本組共有OTU 數(shù)量達(dá)1015 個(gè)，樣本組JN6JN9 和JN12 特有的OTU 數(shù)量分別為303484 和274 個(gè)?；贠TU 的物種分類分析，細(xì)菌種類覆蓋31個(gè)門725 個(gè)屬。其中，樣本組JN9 中特有的OTU 數(shù)目最多，預(yù)示含有較多的特有微生物種類。

2.3 門水平Top10 物種相對(duì)豐度及優(yōu)勢(shì)物種差異分析

對(duì)OTU 的代表序列進(jìn)行物種注釋，根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取3 個(gè)樣本組在門分類水平上最大豐度排名前10 的物種進(jìn)行物種相對(duì)豐度和優(yōu)勢(shì)物種差異分析，結(jié)果顯示各樣本中以金黃色葡萄球菌（占比27%-54%）、大腸埃希菌（占比13%-30%）、銅綠假單孢桿菌（占比12%-30%）和枯草桿菌（占比4% 一10%）的微生物居多，4 種細(xì)菌門總豐度平均為90%。許多對(duì)人體有害的微生物如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌、腦膜膿毒性金黃桿菌、結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌等都屬于這些種類。在生活環(huán)境中，金黃色葡萄球菌細(xì)菌比較常見，即使經(jīng)過消毒殺菌，其再生能力仍然較強(qiáng)。大腸埃希菌細(xì)菌即使處于一些抗生素環(huán)境中也具有較強(qiáng)的生命力。放線菌中絕大多數(shù)是有益菌，也有極少數(shù)會(huì)引起人類的疾病?？莶輻U菌的一些細(xì)菌可以釋放細(xì)胞神經(jīng)毒素從而使人體發(fā)生炎癥性神經(jīng)變性，甚至己經(jīng)可以作為某些環(huán)境下的污染指標(biāo)[3-4]。

3 結(jié)語

采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本16SrDNA 片段進(jìn)行測(cè)序，可以獲得準(zhǔn)確的序列信息和更大的數(shù)據(jù)量，從而在后續(xù)分析中獲得更加深人、全面和可靠的結(jié)果。將此技術(shù)引人室內(nèi)空氣凈化系統(tǒng)的細(xì)菌多樣性分析中，可以提供更加詳實(shí)準(zhǔn)確的信息。通過分析化驗(yàn)室藥廠室內(nèi)新風(fēng)凈化系統(tǒng)隨著使用時(shí)間的延長室內(nèi)空氣中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)室內(nèi)空氣中微生物含量較豐富，群落結(jié)構(gòu)長期變化不大，并且空氣中存在條件致病菌，如奧斯陸莫拉氏菌等。該地區(qū)室內(nèi)新風(fēng)空氣凈化系統(tǒng)使用12 個(gè)月時(shí)存在一定的微生物二次污染風(fēng)險(xiǎn)。