李沛文 吳成余

吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司 吉林長春 130000

多酚氧化酶（PPOs）是植物中廣泛存在的一類銅蛋白物質(zhì)。在煙草中，多酚氧化酶不但在煙草的整個(gè)成長過程中擔(dān)當(dāng)著重要的角色，而且影響著煙葉的顏色和香吃味，所以對煙草的多酚氧化酶的研究也有重要的應(yīng)用前景。本文嘗試從新鮮煙葉中提取多酚氧化酶，并進(jìn)行分離和純化[1]。

1 儀器與藥品

1.1 儀器

多功能食物攪拌機(jī)；超聲波儀；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵；海爾冰箱；LC213 型干燥箱；Z 型系列層析柱；BS-100A 型自動(dòng)部分收集器；HL-2 恒流泵；2000ml 梯度混合器；HD-21-88 核酸蛋白檢測儀；721 分光光度計(jì)；透析袋； 800 型離心機(jī)；PHS-2C型精密酸度計(jì)；XS-204 電子天平；磁力攪拌器；可調(diào)式電爐等。

1.2 藥品及材料

新鮮煙葉； Tris；聚乙烯吡咯烷酮；乙二胺四乙酸二鈉；抗壞血酸；半胱氨酸；磷酸二氫鈉；氯化鈉；硫酸銨；石英砂；十二烷基磺酸鈉；N,N,N,N- 四甲基乙二胺；甲叉丙烯酰胺；丙烯酰胺；過硫酸銨；無水甲醇；冰乙酸等。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 前處理

2.1.1 采集煙葉

從煙田采集一定量的新鮮成熟煙葉，用洗潔劑將其表面的灰塵和污漬清洗干凈，將煙葉切成小的碎片。

2.1.2 粉碎煙葉

把所收集的新鮮煙葉1000g 左右，加入冷丙酮溶液1500mL，浸泡過夜，再用風(fēng)扇將其吹干，然后再用食物粉碎機(jī)粉碎。

2.1.3 均漿煙沫

在粉碎的煙沫中加入pH=7.5 0.05mol/L 的磷酸鹽緩沖液1800mL，再加入12g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。再加入Vc4g，EDTA3g，Cys0.6g。

2.1.4 超聲處理

將均漿物在冰水浴中用超聲波處理一小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞破碎。

2.2 粗分級

（1）將處理的物質(zhì)用六層紗布過濾，收集濾液，加入固體硫酸銨至30% 的飽和度，邊加邊攪拌使之全部溶解，在4℃的條件下靜置4 小時(shí)，然后離心取上清液，再往上清液中加入80% 摩爾濃度的硫酸銨。4℃條件下靜置，然后再離心，收集沉淀。

（2） 得 到 的 沉 淀 用10mL 0.05mol/L 的Tris-HCl 緩 沖 液（pH=7.5）溶解并在此緩沖液中透析平衡20 小時(shí)，這其中每5 小時(shí)換一次透析溶液。

（3）將沉淀透析脫鹽后，用風(fēng)扇吹，使之濃縮，準(zhǔn)備上Sephadex A50 柱（3.5×70cm）。

2.3 細(xì)分級

2. 3.1 柱色譜的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)

稱取50g Sephadex A-50 置于燒杯中，加入適量的0.05mol/L Tris-HCl 緩沖液浸泡經(jīng)48 小時(shí)，除去上層渾濁液中小顆粒。然后將膠液放在真空干燥器中，脫氣20-30 分鐘，然后裝柱，加滿緩沖液，蓋上柱塞連接好管路[2]。

2.3.2 柱色譜分離

整個(gè)過程為首先用DEAE-Sephadex A-50 柱進(jìn)行層析分離，兩部分活性成分分別收集，并用透析袋脫鹽濃縮到10mL，用0.05mol/L 的磷酸緩沖液（pH=7.5）平衡。得到PPO Ⅰ和PPO Ⅱ兩部分，然后分別再經(jīng)過Sephadex G-75 柱（1.5×100cm）分離，收集活性部分并用透析袋脫鹽濃縮到10mL 后用0.05mol/L 的磷酸緩沖液（pH=7.5）平衡，然后再分別過DEAE-Sephadex A-50柱（3×60cm）。

2. 3.3 酶活力和蛋白質(zhì)含量的測定

多酚氧化酶的活性測定和蛋白質(zhì)含量測定采用分光光度法，以鄰苯二酚為底物，在0.05mol/L 的磷酸緩沖液（pH=7.5）中，420nm 的波長下測定酶活力，280nm 的波長下測定蛋白質(zhì)含量。酶活力單位以如下方法定義，即420nm 的波長下每毫克蛋白質(zhì)每分鐘引起0.01 單位的摩爾吸光度的增加為一個(gè)酶活力單位。

表1 分離過程中每一步的相對活力

1- 粗提液；2- 加入30% 硫酸銨后溶液的相對活力；3- 加入80% 硫酸銨后沉淀的相對活力；4- 加入80% 硫酸銨后清液的相對活力；5-DEAE-Sephadex A-50 柱后PPO Ⅰ的相對活力；6-DEAE-Sephadex A-50 柱后PPO Ⅱ的相對活力。

3 結(jié)果與討論

多酚氧化酶的分離分為沉淀法的前處理和層析柱分離的后處理兩個(gè)步驟。前處理中由于多酚及它們的氧化產(chǎn)物的存在抑制了多酚氧化酶的活性，加入一定量的PVP 能降低醌類物質(zhì)的多聚體，從而在一定的程度上能降低多酚對蛋白分離的負(fù)面影響。

后處理經(jīng)層析柱分離，從60-130 管發(fā)現(xiàn)PPO 活性部分，被定義為PPO Ⅰ。PPO Ⅱ比我們前面所發(fā)現(xiàn)的PPO Ⅰ在DEAESephadex A-50 層析柱較后的管數(shù)出現(xiàn)，它的相對活力比PPO Ⅰ要大。在280nm 的波譜圖上我們可以看到，一共有四個(gè)峰，為了確定其活性峰，我們作出了420nm 處的波譜圖，從420nm 波譜圖與280nmm 波譜圖可以得出（圖1），峰I 和峰IV 為活性峰，但它們的吻合程度并不好，說明PPO 中還含有雜蛋白，因此還必須繼續(xù)純化PPO[3]。

圖1 粗蛋白過 DEAE-Sephadex A-50 柱時(shí)的總洗脫曲線，其中A 為280nm 時(shí)的洗脫曲線，B 為420nm 時(shí)的洗脫曲線。色譜柱用0-0.5mol/L 的NaCl 以線性梯度濃度在0.02mol/L Tris-HCl緩沖液中洗脫，pH=7.5，流量18ml/h，4℃。

將過A-50 層析柱后活性較高的PPOI 和PPOII 收集起來裝進(jìn)透析袋進(jìn)行濃縮，脫鹽再分別過Sephadex G-75，然后脫鹽后再分別過A-50 柱層析，結(jié)果在420nm 作出的波譜圖與在280nm 作出的波譜圖吻合得比較好（圖3.2 和圖3.3），說明PPOI 和PPOII提純得比較好，其中沒有雜蛋白了[4]。

圖2 過DEAE-Sephadex A-50 以 及Sephadex G-75 后又一次過DEAE- Sephadex -A50 后PPOI 在280nm（圖A）和420nm（圖B）的總洗脫曲線色譜柱用0-0.5mol/L 的NaCl 以線性梯度濃度在0.02mol/L Tris-HCl 緩沖液中洗脫，pH=7.5，流量18ml/h，4℃。

圖3 過DEAE-Sephadex A-50 以 及Sephadex G-75 后 又一 次 過DEAE- Sephadex -A50 后PPOII 在280nm（ 圖A） 和420nm（圖B）的總洗脫曲線色譜柱用0-0.5mol/L 的NaCl 以線性梯度濃度在0.02mol/L Tris-HCl 緩沖液中洗脫，pH=7.5，流量18ml/h，4℃[5]。

但本文對PPO 只是作了初步試探性的研究，還有不少工作有待進(jìn)一步開展，如怎樣進(jìn)一步選擇適宜的分離手段和條件對多酚氧化酶同工酶進(jìn)行分離和純化，以及如何利用更新的方法對多酚氧化酶性質(zhì)進(jìn)行研究等，都有待更深入的研究。