白及組培苗繁育技術(shù)研究進(jìn)展

戴艷嬌，賀愛國(guó)，陳 錦，宗錦濤，易力雄，陳 頤，熊邵軍

（1. 湖南省農(nóng)業(yè)環(huán)境生態(tài)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；3.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650021； 4.湘西土家族苗族 自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，湖南 吉首 416000）

白及[Bletilla striata（Thunb. ex A. Murray）Rchb. f.]又名白芨，是蘭科白及屬植物，為2015 版藥典中藥材白及的基源植物，具有收斂止血、消腫生肌的功效。因?yàn)閼?yīng)用范圍廣泛，白及又被列入《可用于保健食品的物品名單》和《化妝品原料目錄清單》[1]。早年間，白及藥材主要依賴于野生資源采挖，由于其自然繁殖周期長(zhǎng)、繁殖率低、難度大，被《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》（第2 批）列為二級(jí)保護(hù)植物[2]。為防止野生資源進(jìn)一步遭到破壞，同時(shí)保證白及市場(chǎng)需求，目前主要采用組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行白及種苗繁育。白及種子、假鱗莖、側(cè)芽、幼根和葉片均可作為組織培養(yǎng)的外植體，又因白及蒴果種子量大、可獲得種苗多、萌發(fā)時(shí)間短、形成從芽率高等優(yōu)勢(shì)[3]，生產(chǎn)上多利用白及種子作為外植體進(jìn)行育苗。白及種子作為外植體的組織培養(yǎng)過程通常分為種子萌發(fā)及原球莖誘導(dǎo)階段（又可細(xì)分為種子萌發(fā)誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)2 個(gè)階段[4]）、原球莖增殖分化階段、壯苗生根階段和煉苗移栽。筆者綜述了以上4 個(gè)階段目前取得的研究進(jìn)展，并分析了其中存在的問題，旨在為今后白及組培繁育技術(shù)的研究提供參考。

1 白及組培苗繁育技術(shù)研究進(jìn)展

1.1 種子萌發(fā)及原球莖誘導(dǎo)

目前，大部分利用白及種子作為外植體的研究所用材料多為成熟未開裂的白及種子[4-5]。熊丙全等[6]研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)時(shí)，與成熟種子相比，采用近成熟的白及種子為材料可顯著提高萌發(fā)率，縮短原球莖生產(chǎn)時(shí)間（15 d 左右），能在75～90 d 內(nèi)成苗移栽，且操作程序簡(jiǎn)單，可有效降低育苗成本。液體培養(yǎng)基[7]和固體培養(yǎng)基均可用作白及種子萌發(fā)，其中固體培養(yǎng)基應(yīng)用較為廣泛。

種子萌發(fā)及原球莖誘導(dǎo)階段的無菌環(huán)境是種子萌發(fā)的重要基礎(chǔ)和前提條件。研究表明，5%的氯酸鈉溶液或5%的過氧化氫溶液消毒15 min 均可保證外植體污染率小于5%，且消毒時(shí)間超過15 min 后，污染率受時(shí)間影響變化不大[4]。此外，氯化汞消毒和乙醇消毒也是常用的消毒方式[8]，消毒時(shí)間均以10 min 為宜[9-10]。時(shí)間過短消毒不徹底、污染率高，時(shí)間過長(zhǎng)則會(huì)對(duì)種子活性造成影響，導(dǎo)致萌發(fā)率降低、長(zhǎng)勢(shì)差[9]。

種子萌發(fā)時(shí)的生態(tài)環(huán)境也至關(guān)重要。通常白及種子的萌發(fā)溫度為25±2℃[10]，光照強(qiáng)度為1 800～ 2 500 lx，光照時(shí)間為12 h[4-5]。朱秀蕾[11]用紅藍(lán)光比為1 ∶1 的LED 光源處理白及組培播種苗，發(fā)現(xiàn)白及種子萌發(fā)時(shí)間較對(duì)照組白光處理縮短5 d，該發(fā)現(xiàn)可有效縮短白及種子的培養(yǎng)周期，降低成本。

除環(huán)境因子外，組培中種子萌發(fā)還與培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)條件、外源激素水平密切相關(guān)。使用MS 培養(yǎng)液（無肌醇，無水氯化鈣和硝酸鉀含量均減半）+ 20 g/L 馬鈴薯泥+ 20 g/L 蔗糖的培養(yǎng)基，紫花三叉小白及的種子萌發(fā)誘導(dǎo)率可達(dá)95%[12]。萘乙酸（NAA）和6-芐氨基嘌呤（6-BA）是種子萌發(fā)時(shí)常用的植物激素。對(duì)于紫花白及而言，在MS 培養(yǎng)基中單獨(dú)添加 1.0 mg/L 6-BA 有利于種子萌發(fā)，萌發(fā)率為94%，而單獨(dú)添加1.0 mg/LNAA 后萌發(fā)率僅為47%，顯著低于添加6-BA 的萌發(fā)率[4]；相反的觀點(diǎn)則認(rèn)為在1/2MS 培養(yǎng)基中單獨(dú)添加 1.0 mg/L NAA 更利于種子萌發(fā)，萌發(fā)率為98%，而單獨(dú)添加1.0 mg/L 6-BA 的萌發(fā)率為90%[5]。2 個(gè)研究中種子萌發(fā)過程中的光照、溫度、培養(yǎng)時(shí)間相似，得出結(jié)論卻完全相反，其可能原因之一是試驗(yàn)材料不同，一個(gè)為紫花白及，另一個(gè)則為白及；此外，2 個(gè)試驗(yàn)中添加6-BA 后的萌發(fā)率均較高且相差不多（94%和90%），可能是試驗(yàn)間系統(tǒng)誤差導(dǎo)致的差異；但添加NAA 后的萌發(fā)率卻相差近2 倍（47%和98%），可見種子萌發(fā)誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基中添加NAA 效果并不穩(wěn)定，而添加6-BA 不但效果穩(wěn)定且萌發(fā)率高。也有在此階段將6-BA 和NAA 搭配使用的研究，如張燕 等[13]在1/2 MS 培 養(yǎng)基 中添 加5.0 mg/L 6-BA 和0.2 mg/L NAA，可使增殖倍數(shù)達(dá)2.71；劉敏等[10]在1/2 MS 培養(yǎng) 基 中 添 加1.0 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L NAA，也得到了較好的增殖效果。值得注意的是，在6-BA和NAA 搭配使用的過程中，6-BA 用量遠(yuǎn)大于NAA，綜合各激素單獨(dú)使用的試驗(yàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為6-BA 比NAA 對(duì)白及種子萌發(fā)及原球莖誘導(dǎo)的效果更好。

1.2 原球莖增殖分化

種子萌發(fā)形成原球莖后，原球莖增殖倍數(shù)越高，繁育所得種苗越多。前人研究中增殖系數(shù)最高為14.2，其培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)液（無肌醇，無水氯化鈣和硝酸鉀含量均減半）+ 50.0 g/L 馬鈴薯泥+20.0 g/L 香蕉泥+0.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+25.0 g/L 蔗 糖+2.0 g/L 艾蒿葉干粉[12]；其次為10.0 倍，培養(yǎng)基為1/2 MS+1.5 mg/L N-苯基-N'-1,2,3-噻二唑-5-脲+3.0 g/L活性炭 + 50.0 g/L馬鈴薯泥+30.0 g/L蔗糖[14]。劉敏等[10]用添加了50.0 g/L 馬鈴薯泥的培養(yǎng)基得到增殖倍數(shù)為5.27，而用無馬鈴薯泥的培養(yǎng)基，增殖倍數(shù)僅2.80[5]。這說明馬鈴薯添加物對(duì)白及原球莖增殖具有重要作用。江本利等[15]通過正交試驗(yàn)對(duì)原球莖增殖液體培養(yǎng)基中的馬鈴薯汁濃度、KT 濃度和MS 培養(yǎng)基濃度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在這3 個(gè)因素中，馬鈴薯汁濃度對(duì)原球莖增殖率、增重率和粒徑的影響均最大。楊平飛等[9]的研究也發(fā)現(xiàn)在其他添加物相同的條件下，有馬鈴薯添加物的培養(yǎng)基所培養(yǎng)的白及叢生芽幼苗和球徑均大于無馬鈴薯添加物的培養(yǎng)基。由此可見，馬鈴薯添加物中含有利于白及原球莖增殖的某類或某幾類物質(zhì)，其具體成分有待進(jìn)一步研究。

除馬鈴薯添加物外，植物激素對(duì)原球莖的增殖分化同樣具有重要作用[16-17]。黃穎融等[18]認(rèn)為NAA 是影響白及試管球莖膨大的主要因素，隨NAA 濃度升高，原球莖的鮮重增殖率、直徑增殖率和高度增殖率逐漸增加，當(dāng)NAA 濃度為1.0 mg/L 時(shí)各指標(biāo)達(dá)到最大值。在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，隨著6-BA 濃度從0.5 mg/L 增加到2.0 mg/L，原球莖的增殖數(shù)亦逐漸增加，當(dāng)6-BA 濃度為2.0 mg/L 時(shí)增殖數(shù)最多且增殖所得苗更健壯[19]。此外，外源施用茉莉酸可促進(jìn)白及幼苗生長(zhǎng)，但施用水楊酸則會(huì)抑制白及幼苗生長(zhǎng)，而同時(shí)施用適當(dāng)濃度的茉莉酸、水楊酸和內(nèi)生真菌不但可以提高白及幼苗的抗逆性，還能在一定程度上提高幼苗總酚含量[20]。

保證增殖率的同時(shí)，提高增殖所得球莖質(zhì)量可為幼苗健康成長(zhǎng)奠定良好基礎(chǔ)，增殖后形成的球莖重量越重、直徑越大，則球莖貯藏的養(yǎng)分越多，移栽后種苗成活率越高[18]。如在1/2MS 培養(yǎng)基中添加20.0 g/L蔗糖，得到的球莖直徑較其他蔗糖濃度處理更大[18]。朱秀蕾[11]用LED 光源在原球莖增殖分化階段進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)紅藍(lán)光比為2 ∶1 時(shí)，不但可提高增殖系數(shù)，還能促進(jìn)白及組培苗生根及多糖積累，有利于提高白及品質(zhì)；且相較于單一光源處理，白及幼苗在紅藍(lán)光組合處理或白光處理下更為健壯。

1.3 壯苗生根

白及苗生根情況好壞直接影響著移栽成活率的高低。使用MS 培養(yǎng)液（無肌醇，無水氯化鈣和硝酸鉀含量均減半）+ 80 g/L 香蕉泥+20 g/L 蔗糖+4 g/L 艾蒿葉干粉+0.5 mg/L NAA 的培養(yǎng)基[12]，或者M(jìn)S+2.0 g/L 活性炭+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA 的培養(yǎng)基[14]，均可使生根率達(dá)到100%。另外，在生根培養(yǎng)基中搭配使用NAA 和6-BA 也能得到較好的生根效果[4]。林伊利等[21]進(jìn)一步研究了不同配比的NAA 和6-BA 對(duì)白及苗生根的影響，發(fā)現(xiàn)NAA 對(duì)不定根的分化影響顯著大于6-BA。王躍華等[14]研究了不同濃度IBA 與IAA 配比對(duì)白及苗生根的影響，認(rèn)為IBA 才是影響生根的主要因素。NAA 和IBA 中誰更利于白及不定根的誘導(dǎo)，或者二者組合使用誘導(dǎo)效果如何，目前尚未見報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。此外，培養(yǎng)基中添加蔗糖[18]或香蕉汁[21]均可較好地促進(jìn)白及苗生根。

1.4 煉苗移栽

煉苗是組培苗適應(yīng)外界環(huán)境的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，一般在春夏兩季進(jìn)行，春季最為適宜[22]。以基本產(chǎn)生了假鱗莖且?guī)?～5 條或以上粗壯根系的組培苗為煉苗對(duì)象[23-24]，煉苗溫度范圍以15～28℃為宜[23]，空氣相對(duì)濕度范圍在80%～90%[5]，開瓶鍛煉適應(yīng)時(shí)間不宜超過6 d[25]，若是閉瓶露苗則最佳時(shí)間為30 d[26]。白及組培苗移栽前應(yīng)將根系上的培養(yǎng)基清洗干凈，以防細(xì)菌感染導(dǎo)致根系腐爛，移栽后則要適度遮陰并保持一定的土壤濕度[21,24]。相較于直接將組培苗移栽至基質(zhì)中，移栽前先用30%生根劑將組培苗根浸泡15 min，可將新根長(zhǎng)出時(shí)間縮短為1～4 d，側(cè)芽萌發(fā)率可提高45%左右[14]；也可以先用0.1%多菌靈溶液浸泡整株，然后用1.5 mg/L IBA 浸泡3 h 來提高移栽苗成活率[27]。

移栽基質(zhì)是植株養(yǎng)分、水分的供應(yīng)載體，其通氣性、含水量、酸堿度、養(yǎng)分含量等均會(huì)對(duì)組培苗根系微環(huán)境產(chǎn)生影響，因此移栽基質(zhì)的選擇對(duì)組培苗移栽成活率至關(guān)重要。白及性喜肥，其根系為氣生肉質(zhì)根系，故宜選肥效高、保水透氣性好、微酸性的移栽基質(zhì)[26]。為消除單一基質(zhì)帶來的不良影響，移栽基質(zhì)一般由多種基質(zhì)合理搭配混合而成，如樊金山等[28]發(fā)現(xiàn)用草炭、杏鮑菇菌渣、珍珠巖、稻殼按體積比3∶1∶1∶1的比例混合，或者用草炭、珍珠巖、稻殼按體積比4∶1∶1的比例混合而成的基質(zhì)，其理化性質(zhì)均在適合白及生長(zhǎng)的范圍內(nèi)，且2 a 后植株成活率達(dá)90%以上，植株多糖含量大于70%，塊莖重量大于500 g。還有研究表明，有機(jī)質(zhì)比無機(jī)質(zhì)更適合做白及組培苗栽培基 質(zhì)[29]。例如椰糠[30]、刨花[31]、腐殖質(zhì)[26]、杏鮑菇菌渣[28]、玉米芯[29]等有機(jī)質(zhì)，既富含多種營(yíng)養(yǎng)，又具有良好的透氣保水性，非常有利于白及苗根系生長(zhǎng)，同時(shí)還可為植株生長(zhǎng)提供充足養(yǎng)分。

2 總結(jié)與展望

綜上所述，白及組培苗繁育前2 個(gè)階段較為復(fù)雜和關(guān)鍵，通常認(rèn)為這2 個(gè)階段中植物激素起關(guān)鍵作用[16]，然而不同階段激素濃度和配比不同，增殖效果亦存在一定差異。在種子萌發(fā)及原球莖誘導(dǎo)階段，以近成熟的白及種子作為外植體材料、采用紅藍(lán)光比為 1 ∶1 的LED 光源、在培養(yǎng)基中添加適量的6-BA 等技術(shù)手段均可有效縮短培養(yǎng)周期，提高種子萌發(fā)率，技術(shù)優(yōu)勢(shì)較為突出；在原球莖增殖分化階段，于培養(yǎng)基中添加馬鈴薯添加物可提高增殖系數(shù)，并且該階段NAA 比6-BA 的作用效果更好，選用紅藍(lán)光比為2 ∶1的LED 燈為光源，既可保證較高的增殖系數(shù)，還能促進(jìn)組培苗生根和白及多糖積累，有利于白及品質(zhì)提升；在壯苗生根階段，NAA 和IBA 均能很好地促進(jìn)不定根的生成；在煉苗移栽階段，確定適宜的溫濕度后，可因地制宜選擇保水透氣性好、肥效高的微酸性移栽基質(zhì)，其中以多種混合型有機(jī)質(zhì)為移栽基質(zhì)效果更好。然而，針對(duì)前2 個(gè)階段的多種優(yōu)勢(shì)技術(shù)的研究多為單獨(dú)運(yùn)用，尚無研究將其進(jìn)行有機(jī)融合，同時(shí)運(yùn)用其中的某幾種或全部技術(shù)是否比單獨(dú)運(yùn)用其中一種技術(shù)更具優(yōu)勢(shì)有待進(jìn)一步研究。目前，白及價(jià)格下滑幅度較大[2]，降低組培苗價(jià)格可保證白及種植戶獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)白及產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，因此最大限度的縮短育苗周期、簡(jiǎn)化育苗方式、降低育苗成本將是白及組培苗繁育技術(shù)未來的研究方向。