柚皮苷通過抗氧化機制促進干細胞成骨分化研究進展

齊玉成,王 華,2,陳 培,馮 華,楊旭芳

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江心血管病醫(yī)院放射介入中心,黑龍江 牡丹江 157011)

隨著中國老齡化的進程進入了加速期,骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年遞增的趨勢。骨質(zhì)疏松癥是一種以骨微結(jié)構(gòu)破壞,骨代謝異常,骨折風(fēng)險增加為特征的全身性疾病,嚴重影響了老年人的生活質(zhì)量[1]。近年來,氧化應(yīng)激作為衰老的基本機制之一,在年齡相關(guān)的疾病中顯示著舉足輕重的研究價值?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實了骨質(zhì)疏松癥與氧化應(yīng)激之間存在著密不可分的聯(lián)系[2]。中藥骨碎補作為抗骨質(zhì)疏松癥藥物在骨科的應(yīng)用已有長達千年的歷史,柚皮苷作為骨碎補的有效成分之一,具有抗氧化、原料廉價、副作用少、治療骨質(zhì)疏松癥,促進骨折愈合等成效[1,3-4]。大量研究證實柚皮苷在成骨細胞的增殖分化中扮演著至關(guān)重要的角色,柚皮苷促進成骨細胞特異性基因表達的研究進一步確定了其在骨質(zhì)疏松癥治療中具有不可或缺的地位?，F(xiàn)就柚皮苷對成骨細胞增殖分化的藥理作用及柚皮苷通過抗氧化機制促進成骨分化予以綜述,為柚皮苷防治骨質(zhì)疏松癥的臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1 氧化應(yīng)激與成骨分化

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多而導(dǎo)致的細胞損傷反應(yīng),表現(xiàn)為胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)異常增高,細胞的抗氧化能力不足。骨微結(jié)構(gòu)的形成與溶解吸收之間的協(xié)調(diào)平衡是骨形態(tài)維持的基礎(chǔ),衰老、炎癥與雌激素分泌不足引起的氧化應(yīng)激對骨形態(tài)有著不可忽略的影響。研究表明,氧化應(yīng)激可以對成骨細胞增殖分化的全程均行使功能,其中包括抑制骨髓間充質(zhì)干細胞及成骨前體細胞向成骨細胞分化,減少骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)等轉(zhuǎn)錄因子的表達[5],間接地抑制了細胞內(nèi)BMP-2/Smads/Runx2/Osterix信號軸的轉(zhuǎn)錄[6]。氧化應(yīng)激除了直接或間接作用于成骨細胞的基因和蛋白質(zhì)外還可以作為第二信使直接參與細胞內(nèi)的信號通路,從而調(diào)控成骨細胞的增殖與分化。

2 柚皮苷對成骨細胞增殖與分化的藥理作用

成骨細胞對骨的改建及重塑發(fā)揮著不容忽視的作用,成骨細胞以出芽的方式向類骨質(zhì)中釋放富含鈣結(jié)合蛋白及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的基質(zhì)小泡,促進類骨質(zhì)鈣化。張恩南等[7]體外誘導(dǎo)大鼠干細胞進行成骨分化顯示,一定濃度的柚皮苷可以通過降低氧化應(yīng)激促進成骨分化。Zhang XB等[8]證實體外培養(yǎng)犬骨髓基質(zhì)細胞在柚皮苷的誘導(dǎo)下可以分化為成骨細胞,其中柚皮苷濃度為10-6mol/L時能夠明顯促進骨髓基質(zhì)細胞的增殖及分化。與此同時,Zhang P等[9]通過不同濃度的柚皮苷與人骨髓間充質(zhì)干細胞進行共培養(yǎng),證實1～100 mg/L的柚皮苷溶液可以增強人骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和分化。在體內(nèi)成骨分化研究中,Li N[10]采用去勢大鼠骨質(zhì)疏松模型證實,使用300 mg/Kg濃度的柚皮苷灌藥對大鼠骨密度及骨小梁的構(gòu)建效果顯著。

柚皮苷促進成骨分化不僅具有增強劑作用,而且還具有誘導(dǎo)劑作用。徐高麗等[11]利用不同濃度的柚皮苷單獨作用于小鼠胚胎成骨細胞前體細胞,結(jié)果顯示單純的濃度為1×10-4mol/L的柚皮苷刺激能夠最大程度上提高細胞增殖,促進堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、成骨細胞骨特異性轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor2,Runx2)、Ⅰ型膠原等成骨相關(guān)基因表達。

柚皮苷對間充質(zhì)干細胞向成骨方向定向分化具有促進作用,但最佳濃度尚存爭議,目前主要集中于10-6mol/L～10-4mol/L之間。然而,無論是在體內(nèi)還是體外進行成骨分化的誘導(dǎo),柚皮苷的誘導(dǎo)效應(yīng)均呈現(xiàn)低濃度無效,而高濃度細胞毒性的現(xiàn)象。

3 柚皮苷促進干細胞進行成骨分化的抗氧化分子機制

3.1 柚皮苷對成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子的影響為進一步探討柚皮苷促進成骨分化的作用機制,研究人員從基因水平對柚皮苷促進成骨分化進行了研究,研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷主要上調(diào)間充質(zhì)干細胞的Runx2,BMP及Osterix等基因表達。

3.1.1 Runx2 Runx2作為Runt基因家族的3個成員之一,在骨微環(huán)境的多種細胞中均有表達,參與骨代謝,在骨形成相關(guān)細胞中扮演著至關(guān)重要的角色,是一種成骨分化重要的轉(zhuǎn)錄因子[12]。Runx2通過結(jié)合細胞內(nèi)啟動子進而調(diào)控成骨相關(guān)基因如OCN、ALP等表達。Runx2作為早期成骨細胞分化的標志之一參與多條成骨分化通路的調(diào)節(jié)[13]。體外實驗表明,Runx2不僅參與成骨細胞的分化與成熟,而且還與軟骨細胞及多種骨代謝疾病有著密切聯(lián)系[12]。Yin L等[14]通過研究柚皮苷在體外誘導(dǎo)人牙周膜干細胞的成骨分化過程中證實1×10-6mol/L的柚皮苷可以顯著的提升Runx2、OCN和骨橋蛋白的表達水平 。

3.1.2 BMP BMP是上世紀60年代年由Urist首次提取到的成骨分化關(guān)鍵的胞外調(diào)控因子[15],主要在骨組織中高表達,其他組織分布較少。BMP經(jīng)過旁分泌或自分泌的方式誘導(dǎo)成骨細胞的形成,其受體根據(jù)胞內(nèi)區(qū)的不同將其分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種受體,BMP通過BMP/Smad等多種信號通路共同上調(diào)Runx2及Osterix的表達,從而促進成骨分化[16]。BMP-2在其家族中與成骨分化最為密切,已被廣泛應(yīng)用于骨組織工程的骨缺損修復(fù),并取得令人滿意的效果[17]。劉建林等[18]發(fā)現(xiàn)柚皮苷誘導(dǎo)干細胞骨向分化可能是通過上調(diào)BMP-2及Ⅰ型膠原酶等基因表達,該作用效果可能與BMP-2通路的激活有關(guān)。Wu等[19]發(fā)現(xiàn)柚皮苷可以增加BMP-2的mRNA及蛋白質(zhì)水平,另外柚皮苷還可以抵御體內(nèi)卵巢切除引起的BMP-2減少及骨流失[18]。

3.1.3 Osterix Osterix(OSX)是一種骨形成轉(zhuǎn)錄因子,通常在Runx2下游影響細胞的成骨分化及骨重塑。OSX蛋白具有鋅指結(jié)構(gòu),可以插入到DNA的大溝中直接調(diào)控DNA的轉(zhuǎn)錄[20]。當(dāng)前研究表明,OSX只在骨組織中表達,對干細胞向成骨細胞分化起決定性作用[21]。缺乏OSX基因的小鼠由于缺少軟骨內(nèi)成骨與膜內(nèi)成骨引起成骨細胞來源減少,同時各種成骨分化標志物的表達水平也嚴重下降或者缺失,這些標志物包括Ⅰ型膠原、骨橋蛋白、OCN等[22]。Zhai等[23]對柚皮苷體外誘導(dǎo)乳鼠成骨細胞分化進行檢測,證實柚皮苷具有提高Osterix和Runx2進而促進成骨細胞增殖和分化成熟的能力,在加入雌激素通路抑制劑后表現(xiàn)為柚皮苷的促進作用消失,這表明柚皮苷可能是一種具有抗氧化作用的植物雌激素。

事實上,這三種重要的成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子之間休戚與共,一損俱損。三種轉(zhuǎn)錄因子均可以作為諸多信號通路的參與者,同時也可以作為某些信號通路的靶點,共同調(diào)控干細胞增殖和骨向分化。

3.2 柚皮苷通過抗氧化對成骨分化信號傳導(dǎo)的影響氧化應(yīng)激是造成組織損傷的基礎(chǔ)之一,表現(xiàn)為胞內(nèi)過量的氧自由基及過氧化氫等,這些活性氧類物質(zhì)與胞內(nèi)分子相互作用產(chǎn)生細胞毒性,形成瀑布樣反應(yīng),進一步造成細胞損傷。成骨細胞作為骨形成的基礎(chǔ),對氧化應(yīng)激高度敏感,柚皮苷對干細胞成骨分化的抗氧化作用所涉及的主要信號通路如下。

3.2.1 BMP-2/Smads/Runx2信號軸 BMP-2屬于一種成骨細胞的胞外關(guān)鍵調(diào)控因子。BMP-2可以通過經(jīng)典的Smads和非經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)兩種通路進行調(diào)控[24]。經(jīng)典通路中BMP-2配體-受體結(jié)合將RSmads進行磷酸化,磷酸化的RSmads與Co-Smads形成復(fù)合物入核并結(jié)合靶基因的啟動子啟動Runx2的表達,Runx2還可以通過調(diào)節(jié)多種成骨特異基因促進骨的重塑[13]。非經(jīng)典的BMP-2通路主要通過與MAPK等信號通路相互交聯(lián)從而發(fā)揮作用[24]。研究發(fā)現(xiàn),Ti顆粒誘導(dǎo)后的氧化應(yīng)激小鼠成骨前體細胞明顯下調(diào)了BMP-2/Smads/Runx2信號軸,從而降低了成骨分化的效率[25]。寧宇[26]采用最佳濃度的柚皮苷處理間充質(zhì)干細胞并從分子水平對該信號軸進行檢測,結(jié)果表明柚皮苷能夠通過此信號軸提高成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子的表達從而促進間充質(zhì)干細胞成骨分化。這間接地證明了柚皮苷是可以通過此信號軸發(fā)揮抗氧化效用進而促進骨形成。

3.2.2 PI3K/AKT通路 磷酯酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinsae,PI3K)是一種多功能酶,可以接受G蛋白偶聯(lián)受體和酪氨酸激酶受體的激活,是細胞增殖、衰老和凋亡的重要參與者。在調(diào)控成骨分化和骨生成中,PI3K/AKT通路有著舉足輕重的地位[27]。ROS可以直接作用于該通路從而激活A(yù)KT[28],活化后的AKT可引起下游因子如糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、叉頭型轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)、BMP等的變化,處于PI3K/AKT信號通路的核心位置,影響成骨細胞和破骨細胞的生成與分化,對血管修復(fù)也有一定影響,發(fā)揮調(diào)理骨量和骨強度的效用[29-30]。Wu[19]的實驗分析表明,柚皮苷對BMP-2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是通過AKT的磷酸化和激活蛋白1(AP-1)組分c-Fos和c-Jun的激活介導(dǎo)的。PI3K/AKT作為細胞內(nèi)眾多信號的匯聚點,與多種信號通路的位點均有聯(lián)系,但是PI3K/AKT通路如何調(diào)控其他通路的各級信號分子,以及能否較其他通路抗氧化能力更加高效,值得進一步探索。

3.2.3 Wnt通路 Wnt/β-catenin是一類在進化過程中調(diào)控細胞生長、分化、衰老和凋亡的保守通路。根據(jù)是否有β-catenin的參與可以將其通路分為經(jīng)典Wnt通路與非經(jīng)典Wnt通路,不同的Wnt蛋白激活的Wnt通路各不相同[31]。經(jīng)典Wnt信號通路中,Wnt蛋白促使胞內(nèi)β-catenin磷酸化,磷酸化的β-catenin進入細胞核與T細胞因子/淋巴樣增強因子家族轉(zhuǎn)錄因子相互作用,上調(diào)靶基因Runx2 和Osterix等的表達,促進成骨分化[32]。非經(jīng)典Wnt通路對經(jīng)典Wnt通路具有負反饋的作用,該通路激活可以抑制干細胞的增殖,因此不同環(huán)境下Wnt通路的激活將影響著干細胞分化的方向[31]。Wnt通路不僅調(diào)控骨向分化,對成骨細胞的活性、轉(zhuǎn)錄因子的表達、骨微結(jié)構(gòu)的構(gòu)建均具有直接調(diào)節(jié)作用。新近研究顯示,糖尿病引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致成骨細胞功能障礙,并伴隨Wnt/β-catenin信號的失活[33]。Liu M等[34]研究結(jié)果表明,1～100 mg/L的柚皮苷可通過Wnt通路促進人羊絨膜源性干細胞的成骨作用,柚皮苷可以經(jīng)過BMP途徑抑制破骨細胞生成,并且通過BMP與Wnt兩個通路共同促進干細胞的成骨作用。Wang L等[35]使用柚皮苷成功逆轉(zhuǎn)了H2O2誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子β-catenin蛋白表達下降。此外,在Wnt抑制劑DKK-1作用下,柚皮苷不再有效提高暴露于H2O2的成骨細胞中ALP活性及鈣含量,并下調(diào)了RUNX2和OSX的mRNA表達。

柚皮苷可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路促進成骨分化,同時又有研究報道ROS/FoxO為氧化應(yīng)激的主要調(diào)控通路[36],但柚皮苷是否通過抑制ROS/FoxO通路,從而促進Wnt通路介導(dǎo)的成骨分化尚未見報道。

3.2.4 MAPK通路 MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[37]。MAPK的激活經(jīng)過三級級聯(lián)反應(yīng)依次激活。MAPK主要包括胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)家族、c-Jun N端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)家族、p38蛋白激酶(p38MAPK,p38)家族[38]。ERK信號通路是MAPK通路中研究最為徹底的通路,激素、生長因子、機械力刺激等均可以促進ERK活化,該通路主要影響著細胞的分化成熟[39]。JNK及p38通路經(jīng)過細胞外的應(yīng)激刺激激活,二者又稱MAPK應(yīng)激信號通路,對細胞凋亡有著至關(guān)重要的作用[40-41]。三種通路在細胞分化生長的不同時期表達活性不同。Wang Y[42]證明H2O2顯著降低了人骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和成骨細胞分化。進一步的研究結(jié)果表明,MAPK通路的激活對成骨細胞氧化應(yīng)激作用有著至關(guān)重要的影響。最新研究結(jié)果顯示柚皮苷主要是通過激活MAPK信號通路中ERK1/2通路來增強間充質(zhì)干細胞骨向分化。Wang H等[43]實驗表明0.1g/L的柚皮苷可以顯著促進干細胞成骨分化并提高成骨細胞的礦化,使用ERK1/2MAPK通路抑制劑U0126進一步證明柚皮苷可以逆轉(zhuǎn)被U1026阻斷引起的Runx-2和OSX的低水平表達。Wei K等[44]通過免疫印跡對MAPK信號通路檢測的結(jié)果顯示,柚皮苷主要通過ERK1/2MAPK通路促進人牙周膜干細胞成骨分化,而JNK及p38沒有明顯改變。但是又有研究報道MAPK中的p38和JNK均可促進成骨分化和BMP-2的表達[45],因此對于MAPK的研究尚存爭議,需要廣大學(xué)者進一步研討。

以上研究表明,衰老,雌激素分泌不足等原因引起的氧化應(yīng)激已成為誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的一個高危因素,機制復(fù)雜,諸多機制尚未厘清。柚皮苷通過BMP信號軸及PI3K/AKT通路發(fā)揮抗氧化效用以促進骨形成還需要進一步的研究。許多研究者已經(jīng)證實抗氧化劑在骨形成方面存在著不可磨滅的功效。骨向分化所涉及的信號通路多而復(fù)雜,相互協(xié)調(diào),一個通路的阻斷就可能降低其他通路的成骨效應(yīng),增強骨流失。

4 小結(jié)

骨質(zhì)疏松癥已成為全球性的健康和社會問題,嚴重影響老年人的生存質(zhì)量。氧化應(yīng)激作為機體衰老的基本病理機制之一,對骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)生扮演著至關(guān)重要的角色。柚皮苷在抗氧化治療骨質(zhì)疏松癥方面表現(xiàn)了巨大的臨床應(yīng)用潛力。氧化應(yīng)激對成骨分化的影響機制尚未完全闡述清楚,但氧化應(yīng)激主要通過BMP-2,Wnt,PI3K/AKT及MAPK等通路影響成骨分化,并且以上通路可以相互作用相互影響,形成一個精細龐大的調(diào)控網(wǎng),共同調(diào)節(jié)成骨分化的相關(guān)基因。這表明骨質(zhì)疏松癥的治療需要多個靶點多種機制共同調(diào)控。但是當(dāng)前學(xué)者大多僅對柚皮苷促進成骨分化相關(guān)蛋白及其單條通路的研究鞭辟入里,對各通路之間的相互作用略見一斑。因此,在此方面需要更多的學(xué)者篤志學(xué)習(xí)、深入探索,使骨質(zhì)疏松癥等病癥得到更好的控制,讓更多的人擺脫疾病,重鑄健康生活。