曹 林,李 茜,紀(jì)龍珊,高月求,2,李 曼
1 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 細(xì)胞免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室,上海 200120;2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 肝病科,上海 200120
中性粒細(xì)胞是外周血中最豐富的白細(xì)胞,在先天免疫系統(tǒng)中扮演著重要角色,是機(jī)體應(yīng)對(duì)病原體入侵時(shí)的第一道防線[1],除了通過(guò)胞吞作用吞噬病原微生物、釋放嗜天青顆粒及產(chǎn)生并分泌顆粒狀抗菌分子外,還具有抵抗微生物入侵的新機(jī)制—中性粒細(xì)胞細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)的形成[2-3]。近年來(lái)的報(bào)道[4]表明,NETs可能在包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、血管炎等非傳染性的疾病中發(fā)揮作用。本文主要闡述NETs的形成機(jī)制、結(jié)構(gòu)組成及其在肝病中的最新研究進(jìn)展。
1996年,Takei等[5]用佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)刺激中性粒細(xì)胞時(shí)觀察到其特殊的形態(tài)學(xué)變化,直至2004年Brinkmann等[6]經(jīng)過(guò)驗(yàn)證并將其命名為NETs。NETs的形成不同于細(xì)胞的凋亡與壞死[7],迄今為止,人們提出的NETs釋放的機(jī)制包括:早期非溶解性NETs和晚期溶解性NETs[8],兩者是多種不同受體[Toll樣受體(TLR)、Fc受體和補(bǔ)體受體等]通過(guò)識(shí)別無(wú)菌性和(或)感染性刺激導(dǎo)致中性粒細(xì)胞活化的結(jié)果。對(duì)前者而言,中性粒細(xì)胞通常被白色念珠菌、金黃色葡萄球菌等激活后的5~60 min即可釋放NETs,這一過(guò)程不依賴(lài)于還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶復(fù)合物產(chǎn)生的活性氧(ROS)[9],主要表現(xiàn)為:當(dāng)TLR或某些菌株存在時(shí),直接刺激血小板通過(guò)淋巴細(xì)胞關(guān)聯(lián)抗原1與中性粒細(xì)胞結(jié)合,引起肽基精氨酸脫氨酶(peptidylarginine deiminase,PAD)4的活化,促進(jìn)染色體解聚及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)易位入胞核,隨后經(jīng)蛋白修飾的染色質(zhì)通過(guò)核膜泡化和囊泡排出胞外,形成NETs,胞膜保持完整,細(xì)胞仍保持原有活力[8]。在晚期溶解性NETs中,膽固醇、PMA、IL-8、內(nèi)毒素、Fc受體[10]和A類(lèi)清道夫受體[11]等作用于中性粒細(xì)胞后的1~4 h即可形成NETs,在此過(guò)程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+進(jìn)入胞質(zhì),使得RAF-MEK-MAPK通路或蛋白激酶C 被活化,導(dǎo)致NADPH氧化酶復(fù)合物產(chǎn)生ROS及激活PAD4,加速組蛋白的高聚亞氨酸化,促進(jìn)染色質(zhì)去濃縮。髓過(guò)氧化酶(myeloperoxidase,MPO)是NADPH氧化酶下游的一種酶,隨之儲(chǔ)存在中性粒細(xì)胞顆粒中的MPO和NE,轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,促進(jìn)染色質(zhì)進(jìn)一步展開(kāi),核膜解體,核內(nèi)容物與胞質(zhì)中的顆粒蛋白混合,胞膜破裂,以DNA為基礎(chǔ)的混合物溢出到細(xì)胞外,最終細(xì)胞死亡,釋放NETs[12-13]。
NETs是一個(gè)以DNA為骨架的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),上面裝飾著各種各樣的直徑為25~50 nm不等的球形蛋白結(jié)構(gòu)域[13-14]。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)分析已檢測(cè)到NETs中有多達(dá)80種蛋白質(zhì),其中,纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是NETs發(fā)揮主要功能的物質(zhì),包括去濃縮的染色質(zhì)和組蛋白,組蛋白約占所有與NETs連接的蛋白的70%,后者除了包含MPO、NE外,還含有如組織蛋白酶G、防御素、殺菌/通透性增強(qiáng)性蛋白[15]、乳鐵蛋白、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2[16]、溶菌酶、抗菌肽、膠原酶等來(lái)源于中性粒細(xì)胞不同細(xì)胞器的蛋白,以及蛋白酶3、類(lèi)胰蛋白酶、抗菌肽LL-37[17]等胞漿蛋白[1,18]。
3.1 無(wú)菌性炎癥肝臟疾病 非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一種伴隨有炎癥及肝細(xì)胞損傷的脂肪肝疾病,是發(fā)展成肝癌的危險(xiǎn)因素。研究[19]發(fā)現(xiàn)NASH患者血清中NETs標(biāo)志物(MPO-DNA)的表達(dá)升高;經(jīng)DNase治療或敲除PAD4基因的STAM模型(又稱(chēng)NASH-HCC模型)小鼠,發(fā)現(xiàn)NETs的形成減少,不影響肝內(nèi)脂肪變性和游離脂肪酸的積累,但可防止巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),并將炎癥環(huán)境改變?yōu)椴焕诟伟┥L(zhǎng)的環(huán)境,腫瘤生長(zhǎng)得到抑制,從而降低NASH向肝癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。
肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia and reperfusion injury,IRI)是肝外科疾病中常見(jiàn)的病理過(guò)程。肝臟恢復(fù)血液供應(yīng)后招募大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),受損的肝細(xì)胞釋放高遷移率族蛋白1和組蛋白等損傷相關(guān)的分子模式識(shí)別受體通過(guò)TLR4/9信號(hào)通路介導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs,進(jìn)一步增加肝細(xì)胞死亡,NETs還可以誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞釋放IL-6、TNFα和CXCL-10等炎癥因子和趨化因子以促進(jìn)疾病的發(fā)展,加重?fù)p傷[20]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),小鼠缺血再灌注的損傷后,受損肝臟中的NETs表達(dá)升高,Sergio的團(tuán)隊(duì)[21]在肝臟特異性甲狀腺素結(jié)合球蛋白的驅(qū)動(dòng)下,構(gòu)建了重組腺病毒8型載體(AAV8),用于編碼小鼠體內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶-1的組織抑制劑(TIMP-1),發(fā)現(xiàn)經(jīng)rAAV8-TIMP-1載體處理的C57BL/6小鼠肝臟中TIMP-1選擇性過(guò)表達(dá),過(guò)表達(dá)的TIMP-1會(huì)抑制NETs的形成,對(duì)肝IRI有保護(hù)作用;Suyavaran的團(tuán)隊(duì)[22]發(fā)現(xiàn),分別應(yīng)用NADPH氧化酶2(NOX2)和p38 MAPK信號(hào)通路的抑制劑羅布麻苷和柚皮苷提前干預(yù),可見(jiàn)NETs的釋放、炎癥因子及p38 MAPK的活化受到明顯的抑制,提示NOX2、p38MAPK信號(hào)通路的抑制劑及TIMP-1在將來(lái)可能作為改善IRI患者的有效治療藥物。
3.2 慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化 CHB是HBV感染后,以炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主的病程漫長(zhǎng)的、病情遷延反復(fù)、難以治愈的一種慢性病變[23]。HBV會(huì)影響中性粒細(xì)胞的功能而抑制NETs的釋放。Hu等[24]在體外應(yīng)用重組HBc蛋白和HBe蛋白干預(yù),證實(shí)其可增強(qiáng)mTOR的活性,降低中性粒細(xì)胞的自噬作用及抑制ERK和p38 MAPK的依賴(lài)ROS的激活,減少NETs的釋放,以逃脫被捕獲和殺滅。滿姍姍[25]納入CHB患者和健康人各50例,發(fā)現(xiàn)CHB患者NETs的釋放能力顯著低于健康人,且HBsAg、HBeAg和抗-HBc的水平與NETs的釋放呈負(fù)相關(guān),猜測(cè)HBV可能對(duì)NETs的釋放起抑制作用。HBeAg是一種分泌性非結(jié)構(gòu)蛋白,HBV能夠抑制NLRP3炎癥小體的活化和IL-1β的成熟,主要是HBeAg抑制NF-κB信號(hào)通路和ROS的產(chǎn)生[26],Leu等[27]應(yīng)用重組HBeAg(rHBe)研究發(fā)現(xiàn),rHBe抑制了單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的遷移,在PMA刺激中性粒細(xì)胞后,rHBe降低了兩種細(xì)胞的呼吸爆發(fā),減弱了中性粒細(xì)胞釋放NETs的能力。
肝硬化是一種慢性的、進(jìn)行性的、破壞性的肝臟損害,同時(shí)伴有結(jié)締組織的修復(fù)活動(dòng)和收縮的綜合征[28]。前期報(bào)道[29]指出,肝硬化患者的中性粒細(xì)胞在產(chǎn)生ROS方面存在缺陷,主要體現(xiàn)在超氧陰離子和過(guò)氧化氫的生成,這可能是導(dǎo)致肝硬化患者NETs釋放能力不足的原因。自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis,SBP)是肝硬化患者的一個(gè)重要并發(fā)癥,主要是由于腹腔和腹水的突然感染引起。臨床研究[30]發(fā)現(xiàn),與健康受試者相比,患有SBP的肝硬化患者外周血和腹水中的中性粒細(xì)胞釋放NETs的能力有所降低,主要是由于SBP患者的NADPH氧化酶功能缺失,最終影響ROS的產(chǎn)生,NETs釋放能力受損,這種損傷與肝硬化失代償程度成正比[31]。
3.3 肝癌 Seo等[32]臨床研究結(jié)果顯示,接觸系統(tǒng)的激活和NETs的形成與肝病的嚴(yán)重程度密切相關(guān),與健康者相比,肝細(xì)胞癌(HCC)患者NETs形成的標(biāo)志物(DNA-組蛋白復(fù)合物、雙鏈DNA、NE)和接觸系統(tǒng)的標(biāo)志物(Ⅻa因子、高分子激肽原)的表達(dá)顯著升高,且門(mén)靜脈血栓形成的HCC患者明顯高于無(wú)門(mén)靜脈血栓形成的患者,提示NETs和接觸系統(tǒng)的標(biāo)志物可作為HCC患者血栓形成的危險(xiǎn)因素。體外研究[33]表明,NETs參與了手術(shù)應(yīng)激后向肝轉(zhuǎn)移的發(fā)展,可觸發(fā)癌細(xì)胞釋放高遷移率族蛋白B1,激活TLR9信號(hào)通路,促進(jìn)癌細(xì)胞黏附、增殖、遷移和侵襲,可作為降低腫瘤復(fù)發(fā)的因素。
von Meijenfeldt的團(tuán)隊(duì)[34]發(fā)現(xiàn),在整個(gè)肝移植過(guò)程中,與健康對(duì)照組相比,肝移植患者血漿中游離DNA、核小體和NETs標(biāo)志物的水平較高,圍手術(shù)期時(shí),高表達(dá)的游離DNA和核小體參與肝移植過(guò)程中復(fù)雜的止血平衡,說(shuō)明游離DNA和NETs可能通過(guò)激活凝血作用促進(jìn)肝移植過(guò)程中的止血再平衡。
NETs是細(xì)胞外DNA的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),與抗菌分子有關(guān),已被確定為脊椎動(dòng)物先天免疫防御的一個(gè)重要組成部分[35]。我國(guó)是CHB的高發(fā)病率國(guó)家[36-37],現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,CHB與機(jī)體免疫功能低下有關(guān),HBV感染后會(huì)經(jīng)歷從免疫耐受期到免疫清除期,再到非活動(dòng)期和可能的再活動(dòng)期4個(gè)過(guò)程[38],雖然已發(fā)現(xiàn)HBV能夠抑制NETs的釋放,但具體的作用過(guò)程及相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有待完善。另外,研究[39]指出,NETs可直接殺死癌細(xì)胞或刺激免疫系統(tǒng)而具有抗癌特性,又可能促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和免疫逃逸,或構(gòu)成癌細(xì)胞與免疫功能細(xì)胞之間的物理屏障而具有促癌作用,NETs在肝癌中作用分子機(jī)制報(bào)道較少,還需要深入探討。有證據(jù)表明中性粒細(xì)胞及其細(xì)胞內(nèi)成分在自身免疫性肝病中發(fā)揮作用,但NETs作為一種激發(fā)機(jī)制參與自身免疫性肝病尚未得到詳細(xì)研究[8]。
隨著社會(huì)的進(jìn)步,工作壓力、飲食結(jié)構(gòu)及生活習(xí)慣等引起的酒精性或非酒精性肝病在我國(guó)的患病率迅速升高[40],對(duì)其研究也日益成為焦點(diǎn)。研究指出,急性飲酒會(huì)促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)且加重慢性飲酒引起的肝損傷[41],因此有必要關(guān)注NETs在酒精性或非酒精性肝病中的研究。NETs作為肝病領(lǐng)域中新的研究點(diǎn),探討其作用機(jī)理,細(xì)化其作用靶點(diǎn),勢(shì)必為肝病的治療干預(yù)提供新方向。