中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的形成機(jī)制及在肝病中的作用

曹 林，李 茜，紀(jì)龍珊，高月求,2，李 曼

1 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 細(xì)胞免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海 200120；2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 肝病科，上海 200120

中性粒細(xì)胞是外周血中最豐富的白細(xì)胞，在先天免疫系統(tǒng)中扮演著重要角色，是機(jī)體應(yīng)對(duì)病原體入侵時(shí)的第一道防線[1]，除了通過(guò)胞吞作用吞噬病原微生物、釋放嗜天青顆粒及產(chǎn)生并分泌顆粒狀抗菌分子外，還具有抵抗微生物入侵的新機(jī)制—中性粒細(xì)胞細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)的形成[2-3]。近年來(lái)的報(bào)道[4]表明，NETs可能在包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、血管炎等非傳染性的疾病中發(fā)揮作用。本文主要闡述NETs的形成機(jī)制、結(jié)構(gòu)組成及其在肝病中的最新研究進(jìn)展。

1 NETs的形成機(jī)制

1996年，Takei等[5]用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)刺激中性粒細(xì)胞時(shí)觀察到其特殊的形態(tài)學(xué)變化，直至2004年Brinkmann等[6]經(jīng)過(guò)驗(yàn)證并將其命名為NETs。NETs的形成不同于細(xì)胞的凋亡與壞死[7]，迄今為止，人們提出的NETs釋放的機(jī)制包括：早期非溶解性NETs和晚期溶解性NETs[8]，兩者是多種不同受體[Toll樣受體(TLR)、Fc受體和補(bǔ)體受體等]通過(guò)識(shí)別無(wú)菌性和(或)感染性刺激導(dǎo)致中性粒細(xì)胞活化的結(jié)果。對(duì)前者而言，中性粒細(xì)胞通常被白色念珠菌、金黃色葡萄球菌等激活后的5～60 min即可釋放NETs，這一過(guò)程不依賴(lài)于還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶復(fù)合物產(chǎn)生的活性氧(ROS)[9]，主要表現(xiàn)為：當(dāng)TLR或某些菌株存在時(shí)，直接刺激血小板通過(guò)淋巴細(xì)胞關(guān)聯(lián)抗原1與中性粒細(xì)胞結(jié)合，引起肽基精氨酸脫氨酶(peptidylarginine deiminase，PAD)4的活化，促進(jìn)染色體解聚及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)易位入胞核，隨后經(jīng)蛋白修飾的染色質(zhì)通過(guò)核膜泡化和囊泡排出胞外，形成NETs，胞膜保持完整，細(xì)胞仍保持原有活力[8]。在晚期溶解性NETs中，膽固醇、PMA、IL-8、內(nèi)毒素、Fc受體[10]和A類(lèi)清道夫受體[11]等作用于中性粒細(xì)胞后的1～4 h即可形成NETs，在此過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+進(jìn)入胞質(zhì)，使得RAF-MEK-MAPK通路或蛋白激酶C 被活化，導(dǎo)致NADPH氧化酶復(fù)合物產(chǎn)生ROS及激活PAD4，加速組蛋白的高聚亞氨酸化，促進(jìn)染色質(zhì)去濃縮。髓過(guò)氧化酶(myeloperoxidase，MPO)是NADPH氧化酶下游的一種酶，隨之儲(chǔ)存在中性粒細(xì)胞顆粒中的MPO和NE，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，促進(jìn)染色質(zhì)進(jìn)一步展開(kāi)，核膜解體，核內(nèi)容物與胞質(zhì)中的顆粒蛋白混合，胞膜破裂，以DNA為基礎(chǔ)的混合物溢出到細(xì)胞外，最終細(xì)胞死亡，釋放NETs[12-13]。

2 NETs的結(jié)構(gòu)組成

NETs是一個(gè)以DNA為骨架的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，上面裝飾著各種各樣的直徑為25～50 nm不等的球形蛋白結(jié)構(gòu)域[13-14]。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)分析已檢測(cè)到NETs中有多達(dá)80種蛋白質(zhì)，其中，纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是NETs發(fā)揮主要功能的物質(zhì)，包括去濃縮的染色質(zhì)和組蛋白，組蛋白約占所有與NETs連接的蛋白的70%，后者除了包含MPO、NE外，還含有如組織蛋白酶G、防御素、殺菌/通透性增強(qiáng)性蛋白[15]、乳鐵蛋白、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2[16]、溶菌酶、抗菌肽、膠原酶等來(lái)源于中性粒細(xì)胞不同細(xì)胞器的蛋白,以及蛋白酶3、類(lèi)胰蛋白酶、抗菌肽LL-37[17]等胞漿蛋白[1,18]。

3 NETs在肝病中的研究進(jìn)展

3.1 無(wú)菌性炎癥肝臟疾病 非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一種伴隨有炎癥及肝細(xì)胞損傷的脂肪肝疾病，是發(fā)展成肝癌的危險(xiǎn)因素。研究[19]發(fā)現(xiàn)NASH患者血清中NETs標(biāo)志物(MPO-DNA)的表達(dá)升高；經(jīng)DNase治療或敲除PAD4基因的STAM模型(又稱(chēng)NASH-HCC模型)小鼠，發(fā)現(xiàn)NETs的形成減少，不影響肝內(nèi)脂肪變性和游離脂肪酸的積累，但可防止巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，并將炎癥環(huán)境改變?yōu)椴焕诟伟┥L(zhǎng)的環(huán)境，腫瘤生長(zhǎng)得到抑制，從而降低NASH向肝癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。

肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia and reperfusion injury，IRI)是肝外科疾病中常見(jiàn)的病理過(guò)程。肝臟恢復(fù)血液供應(yīng)后招募大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，受損的肝細(xì)胞釋放高遷移率族蛋白1和組蛋白等損傷相關(guān)的分子模式識(shí)別受體通過(guò)TLR4/9信號(hào)通路介導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs，進(jìn)一步增加肝細(xì)胞死亡，NETs還可以誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞釋放IL-6、TNFα和CXCL-10等炎癥因子和趨化因子以促進(jìn)疾病的發(fā)展，加重?fù)p傷[20]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠缺血再灌注的損傷后，受損肝臟中的NETs表達(dá)升高，Sergio的團(tuán)隊(duì)[21]在肝臟特異性甲狀腺素結(jié)合球蛋白的驅(qū)動(dòng)下，構(gòu)建了重組腺病毒8型載體(AAV8)，用于編碼小鼠體內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶-1的組織抑制劑(TIMP-1)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)rAAV8-TIMP-1載體處理的C57BL/6小鼠肝臟中TIMP-1選擇性過(guò)表達(dá)，過(guò)表達(dá)的TIMP-1會(huì)抑制NETs的形成，對(duì)肝IRI有保護(hù)作用；Suyavaran的團(tuán)隊(duì)[22]發(fā)現(xiàn)，分別應(yīng)用NADPH氧化酶2(NOX2)和p38 MAPK信號(hào)通路的抑制劑羅布麻苷和柚皮苷提前干預(yù)，可見(jiàn)NETs的釋放、炎癥因子及p38 MAPK的活化受到明顯的抑制，提示NOX2、p38MAPK信號(hào)通路的抑制劑及TIMP-1在將來(lái)可能作為改善IRI患者的有效治療藥物。

3.2 慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化 CHB是HBV感染后，以炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主的病程漫長(zhǎng)的、病情遷延反復(fù)、難以治愈的一種慢性病變[23]。HBV會(huì)影響中性粒細(xì)胞的功能而抑制NETs的釋放。Hu等[24]在體外應(yīng)用重組HBc蛋白和HBe蛋白干預(yù)，證實(shí)其可增強(qiáng)mTOR的活性，降低中性粒細(xì)胞的自噬作用及抑制ERK和p38 MAPK的依賴(lài)ROS的激活，減少NETs的釋放，以逃脫被捕獲和殺滅。滿姍姍[25]納入CHB患者和健康人各50例，發(fā)現(xiàn)CHB患者NETs的釋放能力顯著低于健康人，且HBsAg、HBeAg和抗-HBc的水平與NETs的釋放呈負(fù)相關(guān)，猜測(cè)HBV可能對(duì)NETs的釋放起抑制作用。HBeAg是一種分泌性非結(jié)構(gòu)蛋白，HBV能夠抑制NLRP3炎癥小體的活化和IL-1β的成熟，主要是HBeAg抑制NF-κB信號(hào)通路和ROS的產(chǎn)生[26]，Leu等[27]應(yīng)用重組HBeAg(rHBe)研究發(fā)現(xiàn)，rHBe抑制了單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的遷移，在PMA刺激中性粒細(xì)胞后，rHBe降低了兩種細(xì)胞的呼吸爆發(fā)，減弱了中性粒細(xì)胞釋放NETs的能力。

肝硬化是一種慢性的、進(jìn)行性的、破壞性的肝臟損害，同時(shí)伴有結(jié)締組織的修復(fù)活動(dòng)和收縮的綜合征[28]。前期報(bào)道[29]指出，肝硬化患者的中性粒細(xì)胞在產(chǎn)生ROS方面存在缺陷，主要體現(xiàn)在超氧陰離子和過(guò)氧化氫的生成，這可能是導(dǎo)致肝硬化患者NETs釋放能力不足的原因。自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis,SBP)是肝硬化患者的一個(gè)重要并發(fā)癥，主要是由于腹腔和腹水的突然感染引起。臨床研究[30]發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比，患有SBP的肝硬化患者外周血和腹水中的中性粒細(xì)胞釋放NETs的能力有所降低，主要是由于SBP患者的NADPH氧化酶功能缺失，最終影響ROS的產(chǎn)生，NETs釋放能力受損，這種損傷與肝硬化失代償程度成正比[31]。

3.3 肝癌 Seo等[32]臨床研究結(jié)果顯示，接觸系統(tǒng)的激活和NETs的形成與肝病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，與健康者相比，肝細(xì)胞癌(HCC)患者NETs形成的標(biāo)志物(DNA-組蛋白復(fù)合物、雙鏈DNA、NE)和接觸系統(tǒng)的標(biāo)志物(Ⅻa因子、高分子激肽原)的表達(dá)顯著升高，且門(mén)靜脈血栓形成的HCC患者明顯高于無(wú)門(mén)靜脈血栓形成的患者，提示NETs和接觸系統(tǒng)的標(biāo)志物可作為HCC患者血栓形成的危險(xiǎn)因素。體外研究[33]表明，NETs參與了手術(shù)應(yīng)激后向肝轉(zhuǎn)移的發(fā)展，可觸發(fā)癌細(xì)胞釋放高遷移率族蛋白B1，激活TLR9信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞黏附、增殖、遷移和侵襲，可作為降低腫瘤復(fù)發(fā)的因素。

von Meijenfeldt的團(tuán)隊(duì)[34]發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)肝移植過(guò)程中，與健康對(duì)照組相比，肝移植患者血漿中游離DNA、核小體和NETs標(biāo)志物的水平較高，圍手術(shù)期時(shí)，高表達(dá)的游離DNA和核小體參與肝移植過(guò)程中復(fù)雜的止血平衡，說(shuō)明游離DNA和NETs可能通過(guò)激活凝血作用促進(jìn)肝移植過(guò)程中的止血再平衡。

4 小結(jié)

NETs是細(xì)胞外DNA的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與抗菌分子有關(guān)，已被確定為脊椎動(dòng)物先天免疫防御的一個(gè)重要組成部分[35]。我國(guó)是CHB的高發(fā)病率國(guó)家[36-37]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，CHB與機(jī)體免疫功能低下有關(guān)，HBV感染后會(huì)經(jīng)歷從免疫耐受期到免疫清除期，再到非活動(dòng)期和可能的再活動(dòng)期4個(gè)過(guò)程[38]，雖然已發(fā)現(xiàn)HBV能夠抑制NETs的釋放，但具體的作用過(guò)程及相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有待完善。另外，研究[39]指出，NETs可直接殺死癌細(xì)胞或刺激免疫系統(tǒng)而具有抗癌特性，又可能促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和免疫逃逸，或構(gòu)成癌細(xì)胞與免疫功能細(xì)胞之間的物理屏障而具有促癌作用，NETs在肝癌中作用分子機(jī)制報(bào)道較少，還需要深入探討。有證據(jù)表明中性粒細(xì)胞及其細(xì)胞內(nèi)成分在自身免疫性肝病中發(fā)揮作用，但NETs作為一種激發(fā)機(jī)制參與自身免疫性肝病尚未得到詳細(xì)研究[8]。

隨著社會(huì)的進(jìn)步，工作壓力、飲食結(jié)構(gòu)及生活習(xí)慣等引起的酒精性或非酒精性肝病在我國(guó)的患病率迅速升高[40]，對(duì)其研究也日益成為焦點(diǎn)。研究指出，急性飲酒會(huì)促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)且加重慢性飲酒引起的肝損傷[41]，因此有必要關(guān)注NETs在酒精性或非酒精性肝病中的研究。NETs作為肝病領(lǐng)域中新的研究點(diǎn)，探討其作用機(jī)理，細(xì)化其作用靶點(diǎn)，勢(shì)必為肝病的治療干預(yù)提供新方向。