皮質(zhì)醇固相放射免疫分析方法的建立

劉洪奎

（北京北方生物技術(shù)研究所有限公司，北京 100076）

1 材料與方法

1.1 材料

主要儀器與試劑

伽馬放射免疫計(jì)數(shù)器為安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；

皮質(zhì)醇抗原、兔抗-皮質(zhì)醇抗體、放射性核素Na125I溶液、驢抗兔血清、聚苯乙烯試管、皮質(zhì)醇液相RIA藥盒均由北京北方生物技術(shù)研究所有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 驢抗兔抗體親和純化

利用本公司專利技術(shù)，將驢抗兔血清進(jìn)行親和純化，得到親和純驢抗兔抗體。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品配制

用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將皮質(zhì)醇配制成系列濃度點(diǎn)，以0.5 mL每瓶分裝，4℃保存。

1.2.3 皮質(zhì)醇抗體包被管制備

用二抗包被液將驢抗兔配成合適濃度后進(jìn)行第一層包被，再用一抗包被液將皮質(zhì)醇抗體配成合適濃度后進(jìn)行第二層包被，最后加入封閉液抽干干燥，4℃保存。

1.2.4 125I-皮質(zhì)醇標(biāo)記抗原制備

皮質(zhì)醇標(biāo)記抗原采用氯胺-T法進(jìn)行皮質(zhì)醇標(biāo)記抗原的125I標(biāo)記，檢驗(yàn)合格后按要求分裝，4℃保存。

1.2.5 放免分析程序與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

取20 μl皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)品或樣品加入抗體包被管中，加入200 μl125I-皮質(zhì)醇標(biāo)記抗原，37℃水浴1小時(shí)，吸棄反應(yīng)液并洗滌一次，測(cè)定各管的CPM放射性計(jì)數(shù)。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以放射性計(jì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以Logit-log 直線回歸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后計(jì)算出樣品中皮質(zhì)醇的含量。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)優(yōu)化

參照本公司皮質(zhì)醇液相放射免疫分析藥盒的經(jīng)驗(yàn)方法，通過固定125I-皮質(zhì)醇標(biāo)記抗原的量來選擇抗體包被管的包被濃度。本方法學(xué)反應(yīng)溫度采用37℃溫育，通過研究反應(yīng)時(shí)間確保反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)。

2.1.1 驢抗兔抗體濃度的選擇

將純化的驢抗兔抗體稀釋成5個(gè)濃度，包被于聚苯乙烯空白試管；再包被足量的抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)驢抗兔抗體濃度達(dá)到20 μg/mL時(shí)，可以滿足實(shí)驗(yàn)需求。

2.1.2 皮質(zhì)醇抗體滴度的選擇

將抗體稀釋成5個(gè)滴度，進(jìn)行包被，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)抗體滴度達(dá)到1：3000時(shí)，處于比較合適的位置，最終選擇抗體包被滴度為1：3000。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間的選擇

選擇五個(gè)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行37℃溫育。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)達(dá)到平衡點(diǎn)，即反應(yīng)條件為37℃溫育1 h。

2.2 方法學(xué)鑒定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過方法學(xué)建立，得到的皮質(zhì)醇固相放射免疫分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)量范圍為10～500 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-1.61，x=-0.06，r=0.999。

2.2.2 靈敏度

測(cè)定20個(gè)“零”標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)數(shù)值，求出X-2SD值,并將此值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的濃度為0.38 ng/mL，即為此方法學(xué)的靈敏度。

2.2.3 精密度

對(duì)2份含低、高濃度的血清樣品分別在一次實(shí)驗(yàn)中平行多管測(cè)定和在不同實(shí)驗(yàn)中重復(fù)測(cè)定，得到批內(nèi)變異系數(shù)為3.20%～4.53%，批間變異系數(shù)為4.84%～6.76%，可見本方法的精密度較好，符合免疫分析的要求。

2.3 方法學(xué)比較

用本方法分別與液相RIA方法同時(shí)測(cè)量93份血清樣品，對(duì)樣品值進(jìn)行比較?？芍痉椒ㄅc液相RIA方法的相關(guān)性方程為y=0.984x+2.089，相關(guān)系數(shù)r=0.991。說明本方法與市場(chǎng)上合格的液相放射免疫分析方法具有良好的相關(guān)性。

2.4 穩(wěn)定性

將皮質(zhì)醇RIA藥盒置于37℃ 0、1、3、7、10d進(jìn)行放射免疫分析考查其穩(wěn)定性?？芍べ|(zhì)醇RIA藥盒在37℃存放10天能保持良好的穩(wěn)定性。

3 討 論

皮質(zhì)醇對(duì)鑒別診斷Addison和Cushing病，垂體功能減退癥，腎上腺增生，糖尿病和癌癥非常有等均具有重大的臨床意義。以固相RIA技術(shù)（包被管分離）取代傳統(tǒng)的液相RIA技術(shù)（分離劑法分離），使得操作更加簡(jiǎn)便快速，可適合大量臨床樣品的檢測(cè)，尤其是以洗滌代替離心，不僅降低了非特異性結(jié)合，提高了精密度和準(zhǔn)確性，更能推動(dòng)RIA朝自動(dòng)化操作發(fā)展。