馬石霞，馬咸瑩，丁功濤，王家敏

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

小球藻(Chlorella)屬綠藻門(mén)，綠藻目，卵胞藻科，小球藻屬[1].小球藻細(xì)胞呈橢圓形，體積微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)和繁殖速度快，直徑在3～8 μm[2]之間.細(xì)胞內(nèi)通常含有1個(gè)呈板狀或杯狀的葉綠體.

蛋白質(zhì)在藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和代謝中起著重要作用，是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和參與光合作用催化酶的主要成分.與傳統(tǒng)來(lái)源的蛋白質(zhì)相比較，小球藻中通常含有40%～60%的蛋白質(zhì)[3].小球藻含有哺乳動(dòng)物不能合成的必需氨基酸及優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，如乳球蛋白、卵清蛋白等.其氨基酸組成高于世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)頒布的用于人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[4].作為高蛋白食品來(lái)源，小球藻能夠迅速補(bǔ)充體能，因此被FAO列為21世紀(jì)人類(lèi)的健康食品[5].小球藻蛋白具有降血壓和抗氧化的作用.蔡震壽等[6]利用小球藻蛋白質(zhì)水解物對(duì)大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓大鼠灌食60 mg PN-1粉末/350 g體重(相當(dāng)于171.4 mg粉末/kg體重)6 h后，其收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)分別降低2.67 kPa和2.79 kPa重量(BW).王文強(qiáng)[7]和王爽等[8]發(fā)現(xiàn)，酶解小球藻蛋白獲得的水解肽對(duì)DPPH自由基的清除率分別為88.53%和68.93%，對(duì)羥自由基的清除率分別為96.81%和82.00%，具有顯著的抗氧化作用.

盡管小球藻蛋白具有很多的功效，但葉綠素的存在降低了小球藻蛋白的利用率.小球藻中總色素含量約占4%～5%，其中葉綠素占總色素的60%～80%[9].葉綠素是一種色價(jià)較高的鎂卟啉化合物(大于500)，不溶于水，易溶于乙醇、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑，微量即可呈現(xiàn)明顯的綠色.為了降低葉綠素對(duì)小球藻蛋白的感官影響，得到純度和品質(zhì)較高的小球藻蛋白，需將小球藻葉綠素進(jìn)行有效脫除.目前常見(jiàn)脫除色素的方法主要有有機(jī)溶劑浸提法、超聲波輔助提取法和吸附樹(shù)脂法.Kong等[10]利用超聲輔助提取法脫除小球藻葉綠素，發(fā)現(xiàn)在最佳條件下葉綠素的脫除率可達(dá)88.9%.李燦良等[11]利用有機(jī)溶劑浸提法脫除小球藻葉綠素，脫除率可達(dá)53.69 mg/g(藻干物質(zhì)).杜瑩瑩[12]利用改性后的高嶺土脫除藻類(lèi)葉綠素a，最大去除率可達(dá)95%.

本實(shí)驗(yàn)以小球藻粉為原料，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化小球藻葉綠素脫除工藝，并在此基礎(chǔ)上提取純度較高的小球藻蛋白.

1 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)從料液比、脫色液比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間4個(gè)因素對(duì)小球藻葉綠素脫除率的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn).在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)法確定小球藻葉綠素的最佳脫除工藝.在此基礎(chǔ)上，利用熱堿法進(jìn)一步提取小球藻蛋白.

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1.1 材料和試劑

小球藻(購(gòu)自上海光語(yǔ)生物科技有限公司)，無(wú)水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，氫氧化鈉、氫氧化鉀(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，溴甲酚綠、硼酸(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)，甲基紅(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，無(wú)水碳酸鈉(天津市恒興化學(xué)試劑有限公司)，濃鹽酸(開(kāi)封中信中貿(mào)化工有限公司)，濃硫酸(上海三鷹化學(xué)試劑有限公司)，石英砂(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，碳酸鈣(天津市百世化工有限公司).

1.1.2 儀器和設(shè)備

HH-S4A型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)，DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，GL21M型高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)，AR224CN型電子天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)，L9型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)，F(xiàn)OSS scrubber 2501福斯蛋白質(zhì)消化儀(福斯中國(guó)有限公司)，LGJ-20F型真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司).

1.2 小球藻粉葉綠素含量的測(cè)定

1.2.1 葉綠素的脫除

分別稱(chēng)取小球藻粉0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g、1.2 g于研缽中，加入少量二氧化硅(石英砂)和碳酸鈣粉末及2～3 mL 95%乙醇，冰浴中研磨成小球藻泥，再加入10 mL95%乙醇，暗處?kù)o置10 min.將提取液過(guò)濾并用95%乙醇反復(fù)沖洗研缽、研棒和殘?jiān)翢o(wú)色.最后用95%乙醇定容至50 mL棕色容量瓶中，搖勻后保存在暗處備用.

1.2.2 葉綠素的測(cè)定

將上述葉綠素去除液注入光徑1 cm的比色皿中，以95%乙醇作為空白對(duì)照，利用可見(jiàn)-分光光度計(jì)分別在波長(zhǎng)665 nm和649 nm下測(cè)定吸光度.當(dāng)測(cè)得的吸光度值大于0.8或小于0.2時(shí)，葉綠素提取液應(yīng)做適當(dāng)?shù)谋稊?shù)稀釋或濃縮，再對(duì)其進(jìn)行測(cè)定.

根據(jù)下列計(jì)算公式，分別計(jì)算出葉綠素a、b的濃度及其總?cè)~綠素濃度(mg·L-1)[13].

95%乙醇去除液中葉綠素濃度的計(jì)算公式：

Ca(葉綠素a) =13.95A665-6.88A649

(1)

Cb(葉綠素b) =24.96A649-7.32A665

(2)

CT(葉綠素) =Ca+Cb=18.08A649+6.63A665

(3)

式中：Ca、Cb和CT分別為葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的濃度，單位為毫克每升(mg·L-1)；A665和A649為葉綠素提取液在波長(zhǎng)665 nm和649 nm下的吸光度.

按下式計(jì)算小球藻粉中葉綠素的含量(mg·g-1).

(4)

(5)

1.3 小球藻粉蛋白含量的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)中小球藻蛋白含量利用凱氏定氮法[13]測(cè)定.

小球藻蛋白的提取[11]：稱(chēng)取3 g小球藻粉溶于120 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的KOH溶液中， 80 ℃處理2 h后，5 000 r/min離心2 min，棄去上清液，40 mL去離子水洗滌3次后，進(jìn)行冷凍干燥.

蛋白提取率計(jì)算公式：

(6)

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 料液比對(duì)小球藻粉葉綠素脫除率的影響

稱(chēng)取小球藻粉0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g、1.2 g溶于40 mL的脫色液(無(wú)水乙醇︰2%NaOH溶液=1︰4)，70 ℃處理2 h后，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用等量的去離子水洗滌藻泥，重復(fù)4次，進(jìn)行冷凍干燥.利用1.3的方法測(cè)定小球藻粉葉綠素的含量并計(jì)算其脫除率.

1.4.2 脫色液比例對(duì)小球藻粉葉綠素脫除率的影響

分別量取不同比例的脫色液(無(wú)水乙醇︰2%NaOH溶液=1︰3、1︰4、1︰5、1︰6、1︰7)40 mL溶解0.6 g的小球藻粉，70 ℃處理2 h后，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用等量的去離子水洗滌藻泥，重復(fù)4次，進(jìn)行冷凍干燥.利用1.3的方法測(cè)定小球藻粉葉綠素的含量并計(jì)算其脫除率.

1.4.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)小球藻粉葉綠素脫除率的影響

取0.6 g小球藻粉溶于40 mL的脫色液(無(wú)水乙醇︰2%NaOH溶液=1︰4)，70 ℃下處理不同時(shí)間(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2 h、2.5 h)后，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用等量的去離子水洗滌藻泥，重復(fù)4次，進(jìn)行冷凍干燥.利用1.3的方法測(cè)定小球藻粉葉綠素的含量并計(jì)算其脫除率.

1.4.4 反應(yīng)溫度對(duì)小球藻粉葉綠素脫除率的影響

取0.6 g小球藻粉溶于40 mL的脫色液(無(wú)水乙醇︰2%NaOH溶液=1︰4 )，在不同溫度(45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃)下處理2 h后，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用等量的去離子水洗滌藻泥，重復(fù)4次，進(jìn)行冷凍干燥.利用1.3的方法測(cè)定小球藻粉葉綠素的含量并計(jì)算其脫除率.

1.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、脫色液比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間作為試驗(yàn)因素，以小球藻葉綠素脫除率為指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，采用L9(34)的正交試驗(yàn)表，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1.

記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用SPSS和Origin2016軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)小球藻粉葉綠素脫除率的影響

如圖1所示，隨著料液比的增加，葉綠素的脫除率逐漸增大.料液比為1.5︰100時(shí)葉綠素脫除率為92.73%，此后降低.葉綠素與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密，加入過(guò)多的小球藻粉降低了溶液的含水量，葉綠素分子中的親水基團(tuán)很難從葉綠體中游離出來(lái)[14].

圖1 料液比對(duì)葉綠素提取率的影響 圖2 脫色液比例對(duì)葉綠素提取率的影響

2.1.2 脫色液比例對(duì)小球藻粉葉綠素脫除率的影響

如圖2所示，當(dāng)脫色液比例從1︰3增大到1︰4時(shí)，葉綠素的脫除率明顯提高，由86.24%提高至92.48%，此時(shí)小球藻中大部分葉綠素已經(jīng)溶出；當(dāng)脫色液比例超過(guò)1︰4后，葉綠素的脫除率開(kāi)始緩慢降低，原因可能是葉綠素是脂溶性葉綠素，葉綠素的脫除效率受脫色液極性的影響[7].

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)小球藻粉葉綠素脫除率的影響

如圖3所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠素脫除率呈先上升后下降的趨勢(shì).當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到1.5 h時(shí)，葉綠素的脫除率為94.73%.葉綠素通過(guò)自由擴(kuò)散的作用由高濃度的細(xì)胞內(nèi)側(cè)通過(guò)質(zhì)膜擴(kuò)散到低濃度的細(xì)胞外側(cè).當(dāng)時(shí)間為1.5 h時(shí)，細(xì)胞膜兩側(cè)的濃度相差不大，此時(shí)葉綠素的溶解度已經(jīng)達(dá)到最大.當(dāng)時(shí)間超過(guò)1.5 h后，細(xì)胞外側(cè)的濃度高于內(nèi)側(cè)的濃度，葉綠素由細(xì)胞外側(cè)向內(nèi)側(cè)擴(kuò)散，脫除率下降，說(shuō)明最適反應(yīng)時(shí)間為1.5 h.

圖3反應(yīng)時(shí)間對(duì)葉綠素提取率的影響 圖4反應(yīng)溫度對(duì)葉綠素提取率的影響

2.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)小球藻粉葉綠素脫除率的影響

如圖4所示，在45 ℃的溫度下小球藻葉綠素脫除率較低，在45～60 ℃之間，葉綠素脫除率逐步提高，60 ℃時(shí)脫除率為95.50%,此后，葉綠素脫除率有下降的趨勢(shì).葉綠素易溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，不溶于水.本實(shí)驗(yàn)所采用的脫色液(無(wú)水乙醇︰2%NaOH溶液=1︰4)中，無(wú)水乙醇作為萃取劑將水相中的葉綠素萃取至有機(jī)相,從而達(dá)到脫色的目的.但高溫會(huì)加速萃取劑的揮發(fā)，使得有機(jī)相含量降低，葉綠素被大量滯留在水相中，降低葉綠素的脫除率.因此，本實(shí)驗(yàn)采用60 ℃為適宜溫度.

2.2 正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9(34)的正交試驗(yàn)表，選取料液比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、脫色液比例四個(gè)因素，每個(gè)因素選擇三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2中的R值分析可知，對(duì)于葉綠素的提取，A、B、C、D因素對(duì)小球藻葉綠素脫除率的影響次序是A>C>B>D.料液比是重要因素，反應(yīng)溫度是一般因素，反應(yīng)時(shí)間和脫色液比例是次要因素，較優(yōu)組合為A1B2C2D3，即料液比1.5︰100(w/v)、反應(yīng)時(shí)間1.5 h、反應(yīng)溫度60 ℃、脫色液比例1︰6(v/v).選擇該自由組合條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出在該條件下小球藻葉綠素脫除率為96.89%(1±0.0035).與正交試驗(yàn)中提取率最高的一組進(jìn)行比較，可知小球藻葉綠素較佳脫除條件為A1B2C2D3，即料液比1.5︰100(w/v)、反應(yīng)時(shí)間1.5 h、反應(yīng)溫度60 ℃、脫色液比例1︰6(v/v).此條件下小球藻葉綠素的脫除率可達(dá)96.89%.對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 方差分析表

由表3方差分析可以看出,反應(yīng)溫度因素的P=0.042<0.05，為顯著因素，料液比因素的P=0.000<0.01為極顯著因素，而提取時(shí)間和脫色液比例影響不顯著.

2.3 蛋白提取

在對(duì)小球藻蛋白質(zhì)提取進(jìn)行前，采用凱氏定氮法測(cè)得小球藻蛋白的含量占58.60%(1±0.0057)，在脫除小球藻葉綠素的基礎(chǔ)上，利用熱堿法進(jìn)一步提取小球藻蛋白，小球藻蛋白的提取率為39.81%(1±0.0021).

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明，影響小球藻葉綠素脫除率的各因素主次順序?yàn)椋毫弦罕?反應(yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間>脫色液比例.較佳提取工藝條件為料液比1.5︰100(w/v)、反應(yīng)時(shí)間1.5 h、反應(yīng)溫度60 ℃、脫色液比例1︰6(v/v).在此條件下，測(cè)得葉綠素的實(shí)際脫除率為96.89%，與理論脫除率(96.73%)無(wú)顯著性差異.由此可知,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)可以較好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果.在此基礎(chǔ)上，利用熱堿法提取小球藻蛋白，小球藻蛋白的提取率為39.81%.