祝娃娃，王健達(dá)，張險(xiǎn)峰，俞靈鶯

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一，PD主要表現(xiàn)為錐體外系運(yùn)動(dòng)障礙，其主要特征為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直、姿勢(shì)步態(tài)異常等運(yùn)動(dòng)癥狀，中腦黒質(zhì)( substantia nigra，SN)致密帶多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的大量丟失是促進(jìn)帕金森病臨床進(jìn)展的主要因素[1,2]。但是隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)PD患者還會(huì)表現(xiàn)出一系列的非運(yùn)動(dòng)癥狀，例如抑郁、焦慮、便秘、認(rèn)知障礙、睡眠障礙、嗅覺(jué)減退等[3,4]。有文獻(xiàn)報(bào)道在這些非運(yùn)動(dòng)癥狀中，嗅覺(jué)減退的發(fā)生率最高，可達(dá)到70%～90%[5,6]。既往研究表明，除了在黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)存在多巴胺，在嗅球等部位也有分布，很多PD患者嗅覺(jué)障礙可能會(huì)早于運(yùn)動(dòng)癥狀出現(xiàn)[7]。但是目前對(duì)PD嗅覺(jué)障礙的具體機(jī)制尚未完全清楚。本文研究旨在觀(guān)察MPTP小鼠的嗅覺(jué)障礙以及其與嗅球中DA能神經(jīng)元的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組和處理 健康、雄性C57BL/6J小鼠16只,動(dòng)物來(lái)源：上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證：SYXK(浙)2018-0012，SPF級(jí)，體重(20±2) g，隨機(jī)分為兩組(n=8)：(1)對(duì)照組(control)；(2)模型組(MPTP)。模型組腹腔注射MPTP 14 mg/(kg·次)，一共注射4次，每次需要2 h的間隔時(shí)間，要在1 d時(shí)間內(nèi)注射完畢(急性模型劑量和給藥)。對(duì)照組給予等量的生理鹽水。

1.2 行為學(xué)觀(guān)察 各組小鼠在MPTP急性給藥14 d后進(jìn)行運(yùn)動(dòng)能力及嗅覺(jué)功能的行為學(xué)檢測(cè)。

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)(rotarod test)：將小鼠從清潔級(jí)動(dòng)物房轉(zhuǎn)移到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作間，放置60 min讓小鼠適應(yīng)環(huán)境。打開(kāi)轉(zhuǎn)棒裝置，將旋轉(zhuǎn)杠的速度調(diào)節(jié)到20 r/min。然后將小鼠放置在旋轉(zhuǎn)桿上，小鼠從旋轉(zhuǎn)桿上掉落的時(shí)間即為潛伏期，記錄該時(shí)間。并且設(shè)定最長(zhǎng)的潛伏期為300 s。在計(jì)算時(shí)取3次測(cè)試的平均數(shù)。測(cè)試完小鼠后將其轉(zhuǎn)移到清潔級(jí)動(dòng)物房，并且用70%的酒精擦干凈轉(zhuǎn)棒裝置。埋藏餅干實(shí)驗(yàn)(Buried pellet test)：一個(gè)干凈的籠盒(45 cm×24 cm×20 cm)，然后將干凈的墊料均勻的鋪在籠盒的上面，大約 3 cm厚。再將實(shí)驗(yàn)用餅干埋藏在墊料之下，大約0.5 cm，使餅干完全看不見(jiàn)。將小鼠放在實(shí)驗(yàn)籠盒中的正中央，按下計(jì)時(shí)器開(kāi)始計(jì)時(shí)。當(dāng)小鼠找到餅干并且開(kāi)始吃的時(shí)候按下計(jì)時(shí)器停止計(jì)時(shí)，這段時(shí)間則是小鼠尋找餅干的時(shí)間，記錄此數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計(jì)分析。若小鼠在300 s內(nèi)都沒(méi)有找到餅干，則停止計(jì)時(shí)，并記下時(shí)間300 s。木塊實(shí)驗(yàn)(Block test)：準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)用木塊(2 cm×2 cm×2 cm)，分別裝在各自的袋子中，每個(gè)袋子只能裝一個(gè)木塊，然后從每籠小鼠的籠盒中分別取出8 g的墊料填滿(mǎn)各自的袋子中室溫過(guò)夜。在實(shí)驗(yàn)區(qū)域放上兩個(gè)木塊，一個(gè)木塊帶有接受測(cè)試小鼠自身籠盒墊料的氣味；另一個(gè)則是帶有不同氣味的木塊。將小鼠放在實(shí)驗(yàn)籠盒中的正中央，按下計(jì)時(shí)器開(kāi)始2 min的錄像。觀(guān)看錄像，分別數(shù)出小鼠嗅帶有自身籠盒墊料氣味的木塊時(shí)間(own scent)，和嗅帶有不同氣味墊料的木塊時(shí)間(novel scent)，用novel scent/own scent的比值作為數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 動(dòng)物取材 動(dòng)物經(jīng)生理鹽水和4%多聚甲醛灌流固定后，取嗅球在多聚甲醛中固定1 d，再移入5%、85%、95%、100%、100%酒精，由低濃度到高濃度脫水。然后將組織放入二甲苯中脫水，最后用石蠟包埋，切取4 μm厚的冠狀平面的片子。

1.4 免疫組織化學(xué)技術(shù) 二甲苯脫蠟兩次，每次10 min。再用酒精梯度水化，依次為100%、100%、95%、85%、75%，水化時(shí)間分別是10 min、10 min、5 min、5 min、5 min。用PBS漂洗3次，每次5 min，再將玻片放置在檸檬酸緩沖液中微波抗原修復(fù)95 ℃～98 ℃，保持時(shí)間為20 min。自然冷卻切片，用PBS漂洗3次，每次5 min。使用3%過(guò)氧化氫阻斷過(guò)氧化物酶的作用，孵育時(shí)間15 min。之后先用PBS漂洗3次，每次5 min。每片切片滴加100～200 μl一抗于組織上，放在4 ℃冰箱中。第2天，取出切片。用PBS 漂洗3次，每次5 min。每片切片滴加100～200 μl DAB試劑盒中的A液，在室溫下孵育60 min。孵育完成后，用PBS漂洗3次，每次5 min。每片切片滴加100～200 μl DAB試劑盒中的顯色液，室溫顯色2～3 min。使用蘇木精染核數(shù)秒至十幾秒，流水沖洗30 min。酒精梯度脫水，從低濃度到高濃度，依次為75%、85%、95%、100%、100%;水化時(shí)間分別是5 min、5 min、5 min、10 min、10 min。再用二甲苯通透兩次，每次10 min。最后用中性塑膠封片。

1.5 免疫印跡技術(shù) 使用12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠。使用恒定電壓進(jìn)行電泳，當(dāng)樣品在濃縮膠的時(shí)候使用的電壓一般為80～90 V，當(dāng)樣品在濃縮膠的時(shí)候使用的電壓一般為100～120 V。電泳結(jié)束后準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜。把轉(zhuǎn)膜槽放在低溫環(huán)境中330 mA轉(zhuǎn)膜90～120 min。轉(zhuǎn)膜之后用 PBST 洗3×5 min。再放入到5%的脫脂牛奶中封閉1 h。然后敷一抗TH (1∶500)、β-actin(1∶5000)，在4 ℃過(guò)夜。第2天，在室溫下用PBST 洗膜，3×10 min。加入與一抗所相對(duì)應(yīng)的二抗(1∶2000)，在室溫下充分孵育2～3 h，再用PBST洗膜，3×10 min，室溫。最后將ECL底物顯色A、B 液以1∶1混合，加到膜的表面，反應(yīng)1 min。把膜放在凝膠電泳儀上成像，適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間。得到所需蛋白的熒光成像圖。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù) TH陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)在光鏡下分析，陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞漿染成棕褐色。每個(gè)樣本從中挑取3～4片計(jì)數(shù)，取其平均值。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)第14天進(jìn)行行為學(xué)觀(guān)察，MPTP組小鼠出現(xiàn)明顯的行為學(xué)障礙。MPTP小鼠的運(yùn)動(dòng)能力顯著下降(見(jiàn)圖1A)。MPTP小鼠的嗅覺(jué)察覺(jué)和分辨能力也都發(fā)生了明顯的下降(見(jiàn)圖1B、圖1C)，各組小鼠n=6。

圖1 行為學(xué)觀(guān)察MPTP組小鼠出現(xiàn)明顯的行為學(xué)障礙。圖1A顯示MPTP小鼠的運(yùn)動(dòng)能力顯著下降;圖1B和圖1C分別顯示MPTP小鼠的嗅覺(jué)察覺(jué)和分辨能力也都發(fā)生了明顯的下降；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs 相應(yīng)的對(duì)照組，數(shù)據(jù)以表示(n=6)

2.2 TH陽(yáng)性神經(jīng)元在嗅球中的表達(dá) 我們利用免疫組化實(shí)驗(yàn)直觀(guān)的觀(guān)察了嗅球中DA能神經(jīng)元數(shù)量的變化。顯示的是對(duì)照組和MPTP組小鼠嗅球中的TH陽(yáng)性神經(jīng)元(見(jiàn)圖2A、圖2B)。兩組小鼠嗅球中DA能神經(jīng)元數(shù)量的統(tǒng)計(jì)(見(jiàn)圖2C)，各組小鼠n=3。

圖2 免疫組化實(shí)驗(yàn)觀(guān)察嗅球中DA能神經(jīng)元數(shù)量的變化。如圖2A和圖2B分別顯示的是對(duì)照組和MPTP組小鼠嗅球中的TH陽(yáng)性神經(jīng)元;圖1C則是對(duì)兩組小鼠嗅球中DA能神經(jīng)元數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，MPTP小鼠模型嗅球部DA能神經(jīng)數(shù)較生理鹽水組顯著增多；*P<0.05 vs 相應(yīng)的對(duì)照組，數(shù)據(jù)以表示(n=3)

2.3 MPTP組小鼠嗅球中的TH蛋白水平升高 我們用免疫印跡的方法進(jìn)一步驗(yàn)證了MPTP組小鼠嗅球中的TH蛋白表達(dá)水平也是升高的(見(jiàn)圖3)，各組小鼠n=3。

圖3 免疫印跡的方法檢測(cè)MPTP組小鼠嗅球中的TH蛋白表達(dá)水平。如圖3A、3B。MPTP小鼠模型嗅球部TH蛋白表達(dá)較生理鹽水組顯著增多(P<0.05)；*P<0.05 vs 相應(yīng)的對(duì)照組，數(shù)據(jù)以表示(n=3)

3 討 論

帕金森病是一種臨床上常見(jiàn)的進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理特征為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，致紋狀體DA含量下降[8]。以往研究表明，在帕金森病的非運(yùn)動(dòng)癥狀中嗅覺(jué)障礙發(fā)病率極高，嗅覺(jué)功能障礙是帕金森病的一個(gè)早期、常見(jiàn)的特征，通常發(fā)生在運(yùn)動(dòng)癥狀之前數(shù)月甚至數(shù)年[9]。PD的嗅覺(jué)障礙主要表現(xiàn)在氣味識(shí)別、氣味辨別、氣味記憶等各個(gè)方面，但在不同的PD患者中又存在著差異[10]。嗅覺(jué)障礙與PD的疾病進(jìn)展和疾病嚴(yán)重性分級(jí)有關(guān)，其中氣味辨別能力高低也與PD的嚴(yán)重程度相關(guān)，嗅球是嗅覺(jué)通路的重要樞紐，DA作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，除了廣泛存在于黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)中，在嗅球等其他部位也有分布[11,12]，這就提示帕金森病可能存在嗅球多巴胺能神經(jīng)元的異常。

目前帕金森病并發(fā)嗅覺(jué)障礙的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。Galvi[13]通過(guò)行為學(xué)等檢測(cè)方法對(duì)帕金森病患者的嗅覺(jué)功能進(jìn)行測(cè)定，認(rèn)為患者嗅覺(jué)功能的減退與其認(rèn)知功能有關(guān)。既往研究顯示，早期帕金森病患者嗅球內(nèi)小球周細(xì)胞中TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量約為正常對(duì)照組的兩倍，提示早期帕金森病患者嗅覺(jué)喪失可能與嗅球代償性DA增加有關(guān)。但隨著疾病的進(jìn)展，代償效應(yīng)消失后嗅球DA神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少[14,15]。同樣類(lèi)似的報(bào)道出現(xiàn)在MPTP誘導(dǎo)的靈長(zhǎng)動(dòng)物模[12]。此外,有研究表明嗅球中多巴胺表達(dá)量的顯著升高也有可能是其針對(duì)黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元丟失后的一個(gè)快速代償反應(yīng)，在紋狀體也有類(lèi)似的代償反應(yīng)[16,17]。這個(gè)也可以解釋左旋多巴治療后并沒(méi)有改善PD患者嗅覺(jué)障礙的原因。研究發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室室管膜下區(qū)(SVZ)是神經(jīng)再生發(fā)生的主要區(qū)域之一,產(chǎn)生新的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)嘴側(cè)遷移流(RMS)通路運(yùn)輸至嗅球進(jìn)而對(duì)嗅覺(jué)損傷部分進(jìn)行修復(fù)。據(jù)報(bào)道，紋狀體多巴胺能去神經(jīng)化后SVZ增殖減少，嗅球中多巴胺神經(jīng)元數(shù)量代償性增加[18]。綜合以上所述我們可以認(rèn)為嗅球部神經(jīng)元數(shù)目及遞質(zhì)改變可能與嗅覺(jué)障礙有關(guān)系，故需要實(shí)驗(yàn)研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。

建立理想的模型對(duì)于探索發(fā)病機(jī)制、尋求藥物治療是極為重要的。MPTP小鼠模型是目前應(yīng)用最廣泛的PD模型,以往的研究已證實(shí)MPTP 小鼠模型在組織化學(xué)和生物化學(xué)上均符合臨床 PD的特征,是一種較理想的PD模型[19]。在本次實(shí)驗(yàn)中我們利用木塊實(shí)驗(yàn)來(lái)考察小鼠對(duì)氣味辨別的能力。我們發(fā)現(xiàn)與MPTP組小鼠相比，生理鹽水對(duì)照組小鼠明顯更加喜愛(ài)去嗅沾染了不同于自己籠盒內(nèi)墊料氣味的木塊，即這些小鼠具有較強(qiáng)的嗅覺(jué)分辨能力。同樣我們采用了一種十分普遍且簡(jiǎn)單的方法，即埋藏餅干實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)小鼠的嗅覺(jué)察覺(jué)能力。我們的結(jié)果顯示MPTP組的小鼠需要比對(duì)照組花費(fèi)更多的時(shí)間來(lái)尋找埋藏的餅干，這表明MPTP小鼠嗅覺(jué)察覺(jué)閾值升高了。酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是多巴胺合成的限速酶,可作為多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)志,我們對(duì)TH+細(xì)胞的檢測(cè)能直接反映出DA能細(xì)胞數(shù)量。我們用免疫熒光標(biāo)志出TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表示多巴胺能神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)MPTP小鼠模型嗅球部DA能神經(jīng)數(shù)較生理鹽水組顯著增多(P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)我們免疫印跡檢測(cè)TH蛋白發(fā)現(xiàn)MPTP小鼠模型嗅球部TH蛋白表達(dá)較生理鹽水組顯著增多(P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見(jiàn)帕金森病小鼠嗅覺(jué)障礙與嗅球部DA能細(xì)胞增加有關(guān)，為帕金森病并發(fā)嗅覺(jué)功能障礙提供了佐證。但嗅覺(jué)系統(tǒng)是疾病發(fā)生和發(fā)展的重要途徑道，同時(shí)也是治療干預(yù)的早期和可達(dá)窗口。未來(lái)我們可以進(jìn)一步研究帕金森病小鼠嗅覺(jué)障礙是通過(guò)什么機(jī)制上調(diào)TH蛋白的表達(dá)，為尋求有效的藥物治療提供幫助。