大鼠His-Akt1重組蛋白的真核表達、蛋白純化及活性鑒定

孟利 杜彩萍

（徐州醫(yī)科大學 江蘇省腦病生物信息重點實驗室 生物化學與分子生物學研究中心，徐州 221004）

Akt1又稱為PKBɑ，為蛋白激酶B（PKB）家族成員之一，是一種具有多種功能的蛋白激酶。Akt1由480個氨基酸組成，分布廣泛，在各組織中均有表達。Akt1的亞細胞定位受其活性的影響，非活化型Akt1主要定位在細胞胞漿中，活化型的Akt1的亞細胞定位主要是在細胞胞核和胞漿中［1］?；罨腁kt1主要通過磷酸化底物蛋白引起下游信號級聯(lián)反應，進而參與調控細胞生長、存活、增殖、基因轉錄、細胞遷移運動以及細胞周期調控等多種細胞活動［2-6］。

蛋白質翻譯后修飾是調控蛋白質結構與功能的重要方式，磷酸化是Akt1活化所必需的，且Akt1完全活化依賴于其自身的第473位絲氨酸和第308位蘇氨酸的磷酸化［7-8］。研究發(fā)現，除了磷酸化，SUMO化、泛素化、糖基化等翻譯后修飾方式都對Akt1的活性產生影響［9-16］。而蛋白質間相互作用也可引起蛋白活性和功能的改變，目前研究發(fā)現的Akt1結合蛋白已經有很多，它們可能通過與Akt1結合影響其亞細胞定位或者改變其結構而調節(jié)其酶活性［17-19］。為了更加深入和直觀地揭示Akt1的翻譯后修飾及與其他分子的結合對Akt1功能的影響，需要獲得純度較高的高活性Akt1蛋白。本實驗采用分子克隆技術構建了His-Akt1-pcDNA3.1真核表達載體，并將其轉染入HEK293細胞中進行表達，采用Ni-NTA純化及透析獲得高純度和高活性的His-Akt1重組蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 PCR Master Mix、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System均購自Promega公司；GeneClean柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；限制性內切酶Hind Ⅲ、EcoR I、T4 DNA ligase購 自New England Biolabs公司；LB培養(yǎng)基、LB瓊脂、PuriLink Hipure Plasmid Midiprep Kit購自Invitrogen 公司；DL10000 DNA marker 購自TaKaRa公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；Plus Prestained Protein Ladder 購自Thermo公司；抗Akt1蛋白的抗體購自Cell Signaling Technology公司；胰酶、DMEM購自GIBCO公司。透析袋及夾子購自安捷倫公司。測序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.1.2 細胞與質粒 感受態(tài)細胞DH5ɑ購于Transgene公司；HEK293細胞購自上海細胞庫；大鼠Akt1（全長）-pcDNA3.1質粒由本課題組前期構建。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 在上游引物N末端引入6個組氨酸密碼子作為標簽，見表1中加粗堿基，引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 試驗所用引物

1.2.2 His-Akt1重組表達載體的構建 以Akt1（全長）-pcDNA3.1重組體為模板，PCR擴增Akt1 cDNA，用1%瓊脂糖凝膠純化目的基因。用Hind III、EcoR I酶切目的基因和pcDNA3.1，回收純化，將目的基因亞克隆入pcDNA3.1。挑取陽性克隆，提取質粒進行酶切鑒定。將陽性重組質粒委托南京金斯瑞生物科技有限公司測序分析。

1.2.3 HEK293細胞培養(yǎng)與質粒轉染 HEK293細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育。將重組質粒及聚乙烯亞胺（PEI）分別稀釋于無血清DMEM，之后混合充分于室溫靜置15 min，將混合物加入到培養(yǎng)基。2-3 h左右換成含10%胎牛血清的DMEM，24 h后收集細胞。

1.2.4 蛋白定量分析 用改良Lowry法，以牛血清白蛋白（BSA）為標準蛋白，進行蛋白濃度定量。

1.2.5 免疫印跡 取相同量的蛋白樣品加上樣緩沖液4× laemmli，沸水浴5 min變性處理。樣品經SDS-PAGE分離后，電轉到硝酸纖維素（NC）膜上，3% BSA室溫封閉3 h后，用抗Akt1抗體（1∶3 000）孵育過夜，Washing Buffer（10 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20，pH 7.5）洗膜5次，每次3 min。加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗工作液，室溫孵育50 min后，washing buffer洗膜（5 min×5次），用超靈敏化學發(fā)光液顯色，BioChem 化學發(fā)光儀曝光，掃描目的條帶。

1.2.6 蛋白Ni-NTA純化 細胞超聲破碎后，于4℃1 000 ×g離心10 min，留取上清。將上清與預先平衡好的Ni-NTA于4℃ 旋轉孵育3 h。用Washing Buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L 咪唑）洗滌6遍，收集沉淀，之后與 Elution Buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑）于 4℃ 緩慢混勻1 h以洗脫目的蛋白。離心，將上清放入透析袋，置于冰冷的PBS中進行透析，每隔1 h換一次PBS，共需換約8次。最后透析袋中蛋白溶液為純化的目的蛋白。

1.2.7 考馬斯亮藍染色、脫色 SDS-PAGE分離完蛋白后，用考馬斯亮藍染液（45 mL CH3OH，45 mL ddH2O，10 mL CH3COOH，考馬斯亮藍R250：0.25 g）染40 min后，用脫色液（75 mL CH3COOH，50 mL CH3OH 加水定容至1 L）脫色，每隔1 h換一次脫色液，直至凝膠的背景由深藍色變淺至近透明。

2 結果

2.1 His-Akt1-pcDNA3.1真核表達載體的構建

以大鼠野生型Akt1-pcDNA3.1為模板，在上游引物中引入6個His的編碼序列，經PCR擴增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示（圖1-A），于1 500 bp處發(fā)現一條目的條帶，與His-Akt1分子量大小相符。結果表明，His-Akt1目的基因成功擴增。

將擴增的目的基因亞克隆入真核表達載體pcDNA3.1，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示（圖1-B），約7 000 bp處發(fā)現一目的條帶，分子量大小與Akt1（1 500 bp）與pcDNA3.1（5 400 bp）分子量之和一致。將上述重組體經Hind III、EcoR I酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖1-C），呈現兩條DNA條帶，一條位于約5 000 bp處，與pcDNA3.1分子量相符；另一條位于約1 500 bp處，這與His-Akt1分子量相符。結果提示，His-Akt1成功連接入pcDNA3.1。將重組體進行測序鑒定，結果顯示目的基因序列與Gene Bank中模板序列相一致。結果表明，His-Akt1-pcDNA3.1真核表達載體構建成功。

圖1 重組質粒His-Akt1-pcDNA3.1的構建與鑒定

2.2 His-Akt1于HEK293細胞的表達鑒定

將測序正確的His-Akt1-pcDNA3.1真核表達載體轉染入HEK293細胞進行表達。收集細胞樣品，用抗Akt1的抗體進行免疫印跡檢測His-Akt1的蛋白表達情況。結果（圖2）發(fā)現，空細胞對照組中有少量內源性Akt1，轉染His-Akt1組有高豐度Akt1蛋白表達。結果表明，His-Akt1-pcDNA3.1真核表達載體可于HEK293細胞進行高效表達。

圖2 His-Akt1重組蛋白高表達

2.3 His-Akt1蛋白純化鑒定

首先，將4 mg過表達His-Akt1的蛋白混合液經Ni-NTA預吸附后，采用含50 mmol/L咪唑的洗液洗脫非特異蛋白，收集His-Akt1洗脫蛋白，考馬斯亮藍染色結果（圖3-A）顯示，凝膠上除了目的條帶外，還存在較多非特異條帶。接著，分別選取0.5、1、2和4 μg洗脫蛋白進行免疫印跡分析，結果（圖3-B）顯示，除了His-Akt1目的條帶外，還存在非特異性條帶。結果表明，經含50 mmol/L咪唑的洗液得到蛋白純度較低，洗脫條件需要進一步優(yōu)化。

圖3 His-Akt1重組蛋白純度初步鑒定

為了獲得較高純度的目的蛋白，將過 Ni-NTA的總蛋白量減至2 mg，同時將洗液中咪唑濃度增至100 mmol/L。經洗脫后，取洗脫蛋白進行電泳分離和考馬斯亮藍染色，結果（圖4-A）顯示，膠上除了目的蛋白，幾乎沒有非特異性條帶。免疫印跡結果（圖4-B）與此一致。結果表明，取2 mg蛋白過Ni-NTA，用含100 mmol/L咪唑洗液去除非特異性蛋白，可得到較高純度的His-Akt1。

圖4 優(yōu)化純化條件后His-Akt1重組蛋白純度初步鑒定

2.4 His-Akt1蛋白活性鑒定

將上述洗脫蛋白進行透析純化后，分別用抗Akt1 Ser473磷酸化［p-Akt1（S473）］和Thr308磷酸化［p-Akt1（T308）］的抗體進行免疫印跡，檢測His-Akt1磷酸化水平（活化水平）。結果（圖5）顯示，Akt1 Ser473和Thr308均具有較高磷酸化水平。結果表明，純化的Akt1具較高活性。

圖5 免疫印跡檢測His-Akt1 Ser473（S473）和Thr308（T308）磷酸化水平

3 討論

目前，關于Akt1活性調節(jié)的研究已有很多，主要包括磷酸化、泛素化、SUMO化修飾等。研究發(fā)現Akt1失活或者過度活化都與許多疾病相關，如癌癥、精神分裂癥等［20-24］。這就提示我們Akt1的活化需要一個平衡點，因此，關于Akt1活性調節(jié)機制的研究還有很多工作需要去開展。

本實驗通過在目的蛋白Akt1的氨基端人為地加6個His的短肽作為標簽，而6個組氨酸標簽相較于其他標簽，如Myc、Flag、GST標簽有其自身的顯著優(yōu)勢，主要體現：6個組氨酸的標簽蛋白非常小，不會改變目的蛋白質本身的結構；不會改變目的蛋白自身的活性；便于采用固化金屬離子親和層析。

本研究選擇pcDNA3.1真核表達載體來構建His-Akt1重組表達載體，這與原核表達載體相比，雖然不能一次性獲得大量的蛋白，但是真核細胞中表達蛋白具有高活性，并且在體外實驗中開展關于Akt1與其他蛋白分子相互作用的研究所需的蛋白量并不是太多，而需要蛋白的純度較高。

本研究旨在獲得純化的Akt1蛋白，這就需要通過優(yōu)化純化條件，來獲得較高純度的蛋白。從圖3可以看出，在蛋白過 Ni-NTA親和吸附時，過量的蛋白混合液會增加非特異性蛋白結合的可能性。由于含不同濃度咪唑的洗液對非特異性蛋白的洗脫效果也有差別，本實驗通過改變過 Ni-NTA的蛋白量及咪唑的濃度來優(yōu)化蛋白純化條件，提高純化效果，此操作簡單、簡易、有效，整個純化過程操作時間短，較高程度的降低了蛋白降解的可能性，較好地保持了蛋白本身的活性。這為進一步在體外實驗中開展Akt1相關研究提供了新的工具。

4 結論

本實驗采用了分子克隆手段構建了具有高表達活性的His-Akt1-pcDNA3.1真核表達載體，將其轉染入HEK293細胞表達，并通過 Ni-NTA吸附及透析獲得了相應的高活性的純化Akt1蛋白。