水稻花粉外壁孢粉素合成及運輸相關(guān)基因研究進(jìn)展

王聯(lián)紅 張秋云 劉家林 沈亞琦 歐陽林娟 賀浩華 胡麗芳

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南昌 330045；2. 作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點實驗室，南昌 330045）

水稻是重要的糧食作物，其產(chǎn)量與糧食安全息息相關(guān)［1］?；ㄋ幾鳛橹匾纳称鞴?，探討水稻花藥發(fā)育的分子機制對雄性不育系的培育及育種利用有重大意義［1］。花藥中的花粉壁能保護(hù)雄配子免受各種環(huán)境脅迫和病原體攻擊，在花藥的正常發(fā)育中起著不可或缺的作用［2］?；ǚ弁獗冢‥xine）作為花粉壁的外層結(jié)構(gòu)，在花粉壁的形成中起關(guān)鍵作用，其主要成分是孢粉素［3］。孢粉素合成和運輸過程十分復(fù)雜，涉及多種調(diào)控因子共同作用［1］，探究相關(guān)基因的分子作用機制具有重要的理論和實踐意義，歷來受研究者所關(guān)注。

1 花粉外壁和孢粉素

花粉外壁作為圍繞花粉粒的復(fù)雜多層外表面，對雄性生殖發(fā)育至關(guān)重要，在花粉粒的正常發(fā)育及抵抗逆境等方面扮演著重要角色［3］?；ǚ弁獗谟赏獗谕鈱樱⊿exine）和外壁內(nèi)層（Nexine）組成。外壁外層又包括邊緣的頂蓋層（Tectum）和內(nèi)部徑向的柱狀層（Bacula）［3］。花粉外壁形成包括3個步驟：（1）減數(shù)分裂階段形成胼胝質(zhì)；（2）四分體階段通過孢粉素前體生物合成來形成初生外壁；（3）小孢子發(fā)育階段前完成孢粉素前體的沉積和聚合［1，3］。孢粉素是花粉外壁的主要成分，可包裹和保護(hù)花粉粒，在陸地植物進(jìn)化中扮演重要角色［4］。研究表明，它是一種具有抗性的化合物，可對抗長期干旱和各種化學(xué)侵蝕，因而被認(rèn)為是自然界中最堅韌、最耐用的材料之一。

孢粉素的聚合建立包括合成和運輸兩個重要步驟［4］。孢粉素的合成是指孢粉素前體的合成與分泌，孢粉素的運輸是指孢粉素最終運輸至小孢子，并在小孢子上合成精細(xì)外壁結(jié)構(gòu)的過程。孢粉素的合成運輸過程中包含了3個重要階段［5］：（1）孢粉素前體的從頭合成，該過程的調(diào)控因子主要包括?；o酶A合成酶、聚酮合成酶、四肽a-吡咯酮還原酶及細(xì)胞色素P450（CYP450）家族蛋白等［5］。（2）從脂質(zhì)雙分子層到質(zhì)外體的大量分泌，該過程的調(diào)控因子主要包括膜結(jié)合蛋白，如轉(zhuǎn)運蛋白、受體或通道蛋白，質(zhì)膜定位的ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運蛋白，這些調(diào)控因子對脂質(zhì)底物大量運輸不可或缺［5］。（3）脂質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)運，該過程主要為編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白（LTP）家族的基因［5］，其主要為孢粉素前體從絨氈層細(xì)胞傳遞到花粉外壁上提供大量的候選底物。

通過遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的相關(guān)方法對孢粉素合成及運輸過程進(jìn)行研究，目前已鑒定出了一系列與之相關(guān)的基因，這為進(jìn)一步研究水稻花粉外壁的形成機制提供了理論線索。

2 水稻孢粉素合成相關(guān)基因

目前已鑒定出14個與水稻孢粉素合成相關(guān)的基 因，如CYP703A3、CYP704B2、GAMYB、DPW、DPW2、HTH1、OsACOS12、OsCER1、OsCER1、OsNP1、OsPKS1、OsPKS2、OsTKPR1和Wda1等，主要編碼?；o酶A合成酶、聚酮合成酶、四肽a-吡咯酮還原酶、細(xì)胞色素P450（CYP450）家族蛋白及GMC氧化還原酶等（表1）。

細(xì)胞色素P450（CYP450）家族成員CYP703A3和CYP704B2分別參與了脂肪酸的鏈內(nèi)和ω-羥基化途徑［6-7］。CYP703A3可催化花粉外壁形成所需的C10至C14脂肪酸的鏈內(nèi)羥基化［6］，該基因突變可引起花粉外壁和花藥表皮層缺陷。CYP704B2催化C16至C18的v-羥基化脂肪酸的產(chǎn)生［7］，該基因突變會導(dǎo)致絨氈層發(fā)育異常，花粉外壁及花藥角質(zhì)層缺陷［6-7］。CYP703A3的缺失會阻斷高等植物雄性器官發(fā)育所需月桂酸的鏈羥基化反應(yīng)，而CYP704B2的缺失則阻斷了脂肪酸的β-羥基化反應(yīng)，二者的缺失都會進(jìn)一步阻斷了孢粉素脂肪類反應(yīng)底物的合成，從而擾亂了花粉外壁和花藥角質(zhì)層的發(fā)育［7］。GAMYB編碼一種R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子，其主要通過直接影響CYP703A3的表達(dá)水平來影響孢粉素前體的合成［8］。

DPW（Defective Pollen Wall）編碼一種新型的脂肪?；d體蛋白還原酶，對花粉孢粉素生物合成前體初級脂肪醇的合成非常重要［9］，該基因突變導(dǎo)致花粉外壁缺陷，烏氏體異常。DPW系統(tǒng)發(fā)育及功能分析表明其參與的脂肪醇生物合成途徑是孢粉素前體合成的關(guān)鍵。DPW2（Defective Pollen Wall 2）編碼一種催化ω-羥基脂肪酸轉(zhuǎn)化為羥基肉桂輔酶A的BAHD?；D(zhuǎn)移酶［10］，該基因的功能喪失表現(xiàn)出與DPW類似的花粉外壁內(nèi)層II（Nexine II）和花粉內(nèi)壁（Intine）缺失的表型。進(jìn)一步化學(xué)分析表明突變體中芳香酸（肉桂酸和阿魏酸）和v-羥基化脂肪酸的角質(zhì)單體增加［9］，表明DPW2的功能喪失很可能會破壞孢粉素的聚合。

OsACOS12、OsPKS1、OsPKS2和OsTKPR1都參與了苯丙烷代謝途徑，這些基因中的任何一個發(fā)生突變都會顯著影響水稻的雄性生殖能力［11-14］。OsACOS12編碼酰基輔酶A合成酶，參與孢粉素前體所需的脂酰輔酶A合成［11］，影響水稻絨氈層PCD和花藥角質(zhì)層的形成；OsPKS1和OsPKS2編碼聚酮化合物合成酶（PKS），都影響了孢粉素前體生物合成途徑，阻礙了孢粉素的累積，影響了花粉外壁形成［12-13］。OsTKPR1屬于TKPR家族蛋白，催化PKS產(chǎn)生的四酮羰基還原為仲醇，在孢粉素形成 中 起 作 用［14］。OsACOS12、OsPKS1、OsPKS2和OsTKPR1基因突變會導(dǎo)致植株完全或部分雄性不育，其在擬南芥中的同源基因ACOS5、PKSA、PKSB和TKPR1突變同樣導(dǎo)致植株部分或完全不育，這表明ACOS12-PKS1/2-TKPR1孢粉素代謝物在水稻中是保守的［12-13］。

表1 水稻孢粉素合成相關(guān)基因

Wda1編碼一個富含組氨酸基序的蛋白質(zhì)，該基因突變導(dǎo)致了花粉外壁形成缺陷，小孢子發(fā)育嚴(yán)重延遲并最終被破壞［15］。在突變體花藥中烯烴、脂肪酸和伯醇嚴(yán)重減少，表明了其在超長鏈脂肪酸（VLCFAs）中起作用。OsCER1是擬南芥中參與角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成的CER1的同源基因，該基因突變導(dǎo)致水稻絨氈層PCD延遲和質(zhì)體發(fā)育異常，成熟花粉粒內(nèi)的淀粉較少。WDA1與OsCER1通過參與VLCFAs的生物合成來影響孢粉素前體形成［16］，盡管Wda1與OsCER1具有較高的同源性，然而在OsCER1表達(dá)量降低的植株中qRT-PCR發(fā)現(xiàn)WDA1只在花藥發(fā)育第7階段表達(dá)顯著增加，而在其他花藥發(fā)育階段沒有觀察到明顯的變化，表明OsCER1可能參與除WDA1以外的不同途徑來影響孢粉素合成。

OsNP1和HTH1都編碼葡萄糖-甲醇-膽堿（GMC）氧化還原酶。OsNP1催化脂肪醇氧化成相應(yīng)醛，參與聚合或組裝孢粉素前體所需的脂質(zhì)分子的產(chǎn)生，OsNP1突變導(dǎo)致花藥變小，角質(zhì)層缺陷且外壁形成不規(guī)則［17］。HTH1可作為鄰羥基脂肪酸脫氫酶起作用，催化長鏈鄰羥基脂肪酸向長鏈α-，鄰二羧酸脂肪酸的氧化，該基因突變導(dǎo)致花粉育性和活力顯著降低，突變體花藥壁塌陷和角質(zhì)層較薄。鑒于HTH1的最適底物為C18脂肪酸［18］，其功能類似于CYP704B2在角質(zhì)生物合成中的功能在孢粉素前體物質(zhì)的合成中起作用。

OsGPAT3編碼一個保守的甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶，該基因突變導(dǎo)致花粉外壁扭曲，花粉內(nèi)壁缺失［19］。通過分析突變體中與孢粉素前體合成相關(guān)基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CYP704B2、CYP703A3、OsACOS12、DPW、DPW2、WDA1和OsNP1等7個基因的表達(dá)水平都顯著降低［19］，推測OsGPAT3可能通過直接或間接影響孢粉素合成代謝基因來確保孢粉素前體的順利合成。

3 水稻孢粉素運輸相關(guān)基因

目前已鑒定出8個與水稻孢粉素運輸相關(guān)的 基 因，包 括DPW3、OsABCG15、OsABCG26、OsABCG3、OsC6/Osg6B、OsEMF2b、OsLecRK-S.7和PTC1等，主要編碼ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運蛋白、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白（LTP）和PHD-finger蛋白（表2）。

表2 水稻孢粉素運輸相關(guān)基因

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白利用ATP衍生的能量，在細(xì)胞膜上運輸大量的脂質(zhì)分子［20］。OsABCG3基因突變導(dǎo)致絨氈層異常降解，花粉缺乏花粉內(nèi)壁和外壁內(nèi)層II。除OsABCG3外，其他兩個ABCG家族成員OsABCG15和OsABCG26也在水稻花粉發(fā)育和雄性育性中所必需的［20-21］，其中任一基因的功能喪失都會導(dǎo)致完全雄性不育。OsABCG26主要協(xié)同孢粉素前體從絨氈層細(xì)胞向花藥壁運輸，而OsABCG15主要協(xié)同孢粉素前體從絨氈層細(xì)胞向花藥室運輸，OsABCG3尚不清楚其具體功能。OsABCG3、OsABCG15和OsABCG26都優(yōu)先在花藥中表達(dá)，相關(guān)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，OsABCG3的突變不會影響OsABCG15和OsABCG26的 表 達(dá)，OsABCG15的突變也不影響OsABCG3的表達(dá)，但OsABCG26的突變會影響OsABCG3的表達(dá)［21］，推測OsABCG3和OsABCG15可能參與到不同的代謝途徑中，而OsABCG26和OsABCG3可能處于同一代謝途徑中，通過相互的反應(yīng)底物的反饋調(diào)節(jié)關(guān)系來協(xié)同調(diào)節(jié)水稻的雄性生殖發(fā)育［22］。

PTC1編碼PHD-finger蛋白，該基因突變導(dǎo)致植株花藥微黃且小，花粉外壁形成缺陷［23］。PTC1作為轉(zhuǎn)錄因子會通過調(diào)節(jié)下游靶向基因一起作用，研究表明參與孢粉素前體的生物合成和轉(zhuǎn)運的基因都是PTC1的潛在目標(biāo)［23］。

OsEMF2b編碼一種核心的PcG（Polycomb Group）蛋白，可促進(jìn)水稻組蛋白H3的第27個氨基酸上三甲基化（H3K27me3）的沉積，該基因突變表現(xiàn)為花藥壁缺陷和花粉發(fā)育異常。OsEMF2b和PTC1還可通過組蛋白甲基化修飾在花藥和小孢子發(fā)育中共同發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)水稻花粉外壁形成［24］。

OsLecRK-S.7編碼一種新的定位于質(zhì)膜的豆莢凝集素受體激酶，會啟動近膜區(qū)的磷酸化傳譯，在花粉發(fā)育中起關(guān)鍵作用［25］。該基因突變會引起花粉外壁和萌發(fā)孔形成出現(xiàn)缺陷，導(dǎo)致階段性質(zhì)膜的不穩(wěn)定和花粉細(xì)胞的死亡。通過基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，與孢粉素合成運輸相關(guān)基因的表達(dá)水平包括OsCYP703A3、DPW、OsCYP704B2、OsPKS1、OsPKS2、DPW2、OsACOS12、OsC6、OsABCG15和OsABCG26在突變體中顯著升高，推測突變體中花粉外壁增厚可能與孢粉素合成和運輸相關(guān)基因高表達(dá)有關(guān)，但其存在的級聯(lián)調(diào)節(jié)機制尚不清楚［25］。

DPW3編碼一種在陸地植物中保存的與膜相關(guān)的整合素蛋白。DPW3對孢粉素的運輸會產(chǎn)生顯著影響，基因突變會導(dǎo)致花藥角質(zhì)層不平衡、胼胝質(zhì)沉積中斷以及小孢子質(zhì)膜波動異常［26-27］。

OsC6編碼一種攜帶脂質(zhì)分子進(jìn)入細(xì)胞外空間的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白［28］。OsC6可將脂質(zhì)前體從絨氈層轉(zhuǎn)移到花藥室，在孢粉素轉(zhuǎn)運中起關(guān)鍵作用，該基因突變會導(dǎo)致烏氏體缺陷和花粉外壁發(fā)育不良。OsC6同時還受另一個參與孢粉素代謝基因GAMYB的調(diào)節(jié)，在gamyb突變體中OsC6的表達(dá)水平顯著降低，GAMYB可能通過控制OsC6的表達(dá)來共同調(diào)控孢粉素的運輸。

4 總結(jié)與展望

圖1 水稻孢粉素合成及運輸相關(guān)基因模式圖

通過歸納分析水稻花粉外壁中孢粉素合成及運輸相關(guān)基因可以發(fā)現(xiàn)，孢粉素的合成需要多種脂肪化合物的生物合成，特別是超長鏈羥基化脂肪酸，其可能是構(gòu)建孢粉素的關(guān)鍵前體［2，29］?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)分析表明，至少有數(shù)百個基因在水稻孢粉素合成運輸中具有推定功能，這些基因的表達(dá)對如何協(xié)調(diào)孢粉素合成運輸以及花粉外壁的后續(xù)發(fā)育尚未得到很好的研究。

進(jìn)一步的分析表明，某些基因間還存在著一定的級聯(lián)調(diào)控關(guān)系來控制孢粉素合成運輸（圖1）。PTC1和OsEMF2b在GAMYB的下游，GAMYB可正向調(diào)控OsC6、CYP704B2和CYP703A3，而OsEMF2b基因的上調(diào)可導(dǎo)致包括GAMYB在內(nèi)的14個基因的表達(dá)上調(diào)及PTC1表達(dá)下調(diào)，表明OsEMF2b編碼的多梳蛋白家族對孢粉素運輸可能具有重要意義［30］?；騉sGPAT3表達(dá)量的降低會導(dǎo)致CYP704B2、CYP703A3、OsACOS12、DPW、DPW2、WDA1和OsNP1表達(dá)量顯著降低，而GAMYB的表達(dá)量顯著上升，表明OsGPAT3可能通過調(diào)節(jié)GAMYB的表達(dá)進(jìn)一步調(diào)節(jié)其他孢粉素合成相關(guān)基因的表達(dá)，而PTC1可能參與其他平行的調(diào)節(jié)途徑。但目前關(guān)于OsGPAT3在水稻絨氈層發(fā)育中的功能網(wǎng)絡(luò)仍不清楚，未來的研究需要通過對已知的孢粉素代謝相關(guān)突變體中的基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，并進(jìn)一步通過遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的方法來確定其潛在的上下游調(diào)節(jié)因 子［31-32］。ACOS12、CYP703A、CYP704B、PTC1是孢粉素合成運輸?shù)谋仨毭福彩顷懙刂参镏斜４孑^好的家族，可繼續(xù)挖掘更深入的互作關(guān)系［33］。由于OsLecRK-S.7突變體中OsNP1的表達(dá)水平顯著降低，OsC6、OsABCG15及OsABCG26表達(dá)升高，猜測OsLecRK-S.7在OsNP1的下游，OsC6及ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因的上游［34］，由于LecRLK蛋白在孢粉素合成運輸途徑中的具體作用機制尚不清楚，下一步可通過相關(guān)基因表達(dá)量的大數(shù)據(jù)分析來探究其級聯(lián)調(diào)控機制。

迄今為止，許多脂質(zhì)介導(dǎo)的雄性不育相關(guān)的基因已被分離鑒定。比如兩個細(xì)胞色素P450家族基因：CYP704B2和CYP703A3，是羥基化脂肪酸的催化劑［35-36］。DPW作為脂肪?；d體蛋白還原酶影響角質(zhì)和蠟質(zhì)的積累，DPW2作為脂肪酸酰基轉(zhuǎn)移酶影響脂質(zhì)和酚類化合物的積累［37］。ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因OsABCG3、OsABCG15和OsABCG26協(xié)同工作，但發(fā)揮其自身功能，運輸不同材料幫助花粉外壁形成［4，38］。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因OsC6分泌到花藥角質(zhì)層、花藥室以及絨氈層和中間層之間的空間，用于花粉外壁形成［39］。另外，WDA1、OsNP1和OsPKS2還可以調(diào)節(jié)孢粉素的生物合成和沉積［1，40-41］。這些基因的功能喪失不僅導(dǎo)致孢粉素合成運輸受阻，而且還導(dǎo)致花藥角質(zhì)層和花粉外壁缺失，從而導(dǎo)致植株不育。然而，我們對花粉壁中芳香脂質(zhì)的了解相當(dāng)有限［41］，譬如脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域在孢粉素形成過程中如何與芳香結(jié)構(gòu)域相互連接仍然未知。因此，將來需要使用更靈敏的技術(shù)來分析孢粉素成分，使其保持原有的化學(xué)特性，再使用一致的技術(shù)來鑒定各類孢粉素成分。此外，胼胝體壁是通過哪種細(xì)胞機制來協(xié)助孢粉素進(jìn)行沉積的還不清楚，今后需要更多涉及OsEMF2b羥基化步驟的信息，了解其與調(diào)控孢粉素合成運輸關(guān)鍵基因之間的互作關(guān)系。隨著相關(guān)技術(shù)的迅速發(fā)展以及基因編輯技術(shù)廣泛應(yīng)用，越來越多參與編碼花粉壁發(fā)育相關(guān)蛋白基因功能將被逐步闡明，這將為人們充分理解水稻花粉壁發(fā)育的調(diào)控機制奠定堅實基礎(chǔ)［21］。