萜類化合物在釀酒酵母中的合成生物學(xué)研究進(jìn)展

李佳秀 蔡倩茹 吳杰群

（浙江工業(yè)大學(xué)綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310014）

萜類化合物（Terpenoids）是自然界中普遍存在的最大類的天然產(chǎn)物，目前已鑒定得到的種類超過(guò)55 000多個(gè)，占所有天然化合物的60%［1］。萜類化合物多樣性豐富，具有廣泛的生物學(xué)功能，作為代謝產(chǎn)物在細(xì)胞層面影響其組成和能量供應(yīng)，作為激素等媒介因子影響生物體之間的拮抗和互生共生關(guān)系［2］。萜類化合物可以保護(hù)多種植物、動(dòng)物和微生物免受捕食者、病原體和競(jìng)爭(zhēng)者的攻擊，并參與生物種群中關(guān)于食物、配偶和敵人的信息傳達(dá)［3］。在過(guò)去幾十年中，由于其多樣的生物活性和極高的生物利用價(jià)值，萜類化合物已被廣泛用于醫(yī)藥和工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域，市場(chǎng)需求巨大［4-5］。

目前，萜類化合物有以下3種生產(chǎn)方式：傳統(tǒng)提取法、化學(xué)合成法以及微生物合成法。由于大多數(shù)產(chǎn)業(yè)應(yīng)用規(guī)模化的萜類化合物為次級(jí)代謝產(chǎn)物，含量較低且分離過(guò)程復(fù)雜，從天然原料中提取的萜類化合物的產(chǎn)量難以滿足市場(chǎng)需求，且會(huì)消耗大量生物資源，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成不可逆的影響［6］。例如，人參干燥根中人參皂苷的含量?jī)H為其干重的0.01%［7］。提取1 kg的紫杉醇需要砍伐數(shù)千株成熟紅豆杉，為提供一個(gè)癌癥病人所需的治療劑量需要犧牲2-4株成年樹［8］。同時(shí)，由于萜類化合物本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，通過(guò)化學(xué)方法全合成復(fù)雜萜類化合物的路線繁瑣，反應(yīng)條件、原料較為苛刻，得率極低，同樣不能滿足工業(yè)生產(chǎn)需要。例如，紫杉醇的全合成需要35-51個(gè)步驟，最高產(chǎn)率僅0.4%［9］。微生物發(fā)酵生產(chǎn)萜類化合物具有成本低廉、綠色環(huán)保、生產(chǎn)效率高等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)合成生物學(xué)的興起也使真核來(lái)源的復(fù)雜萜類化合物的微生物合成得以實(shí)現(xiàn)。

合成生物學(xué)是一門綜合學(xué)科，它將工程方法與化學(xué)、生物學(xué)、數(shù)學(xué)和物理學(xué)等基礎(chǔ)科學(xué)方法相結(jié)合［10］，在非自然化學(xué)系統(tǒng)中重現(xiàn)了生命系統(tǒng)遺傳和進(jìn)化的特性［11］。依托合成生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)，科學(xué)家們?cè)趶?fù)雜萜類化合物來(lái)源生物（微生物、植物和真菌）中收集與其生化途徑相關(guān)編碼酶的基因，對(duì)其修飾和改良后引入經(jīng)工程改造、適合生產(chǎn)的底盤細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)高價(jià)值萜類化合物的生物合成［6］?？汞懠菜幬锴噍锼厍绑w青蒿酸在釀酒酵母中的高效異源表達(dá)就是合成生物學(xué)研究的標(biāo)志性成果［12-13］。目前，通過(guò)合成生物學(xué)與后續(xù)化學(xué)修飾工藝耦合，青蒿素的工業(yè)生產(chǎn)成本已與植物提取相當(dāng)。自此，關(guān)于微生物合成復(fù)雜萜類化合物研究的創(chuàng)新成果層出不窮。人參皂苷Rh2來(lái)源于人參屬植物，是一種癌癥預(yù)防及治療的候選藥物。Wang等［7］通過(guò)模塊化工程設(shè)計(jì)優(yōu)化了甲羥戊酸途徑以及人參皂苷P450酶的表達(dá)水平，構(gòu)建了高產(chǎn)人參皂苷糖苷配糖原二醇（Protopanaxadiol，PPD）的底盤細(xì)胞，從而提高了人參皂苷Rh2的產(chǎn)量（10 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)量為2.25 g/L）。青蒿素和人參皂苷僅是數(shù)以千計(jì)潛在的高價(jià)值萜類化合物中的兩種，合成生物學(xué)方法為合成多元化高價(jià)值萜類化合物提供了可持續(xù)的生產(chǎn)途徑，并為新化合物的發(fā)現(xiàn)開辟了新的可能性。

釀酒酵母由于其遺傳操作便捷、培養(yǎng)成本低、抗噬菌體感染、具有真核表達(dá)修飾系統(tǒng)等特點(diǎn)，被廣泛用于生產(chǎn)各種小分子和大分子化合物，是許多生物過(guò)程的首選底盤細(xì)胞［14-15］。近年來(lái)，基因合成成本大幅降低［16］，基因編輯技術(shù)不斷革新（如CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用［17］），合成生物學(xué)在生物技術(shù)工業(yè)中的應(yīng)用正在加速發(fā)展［18-19］。越來(lái)越多基于釀酒酵母底盤細(xì)胞的合成生物學(xué)策略應(yīng)用于高價(jià)值萜類化合物的生物合成。因此，本文將從優(yōu)化異戊二烯前體途徑酶、改造中央碳代謝、平衡競(jìng)爭(zhēng)途徑、異源表達(dá)細(xì)胞色素P450酶4個(gè)方面闡述在釀酒酵母底盤細(xì)胞中高價(jià)值萜類化合物的合成生物學(xué)的最新策略與進(jìn)展。

1 優(yōu)化異戊二烯前體途徑相關(guān)酶

萜類化合物定義為以2-甲基丁-1，3-二烯（又名異戊二烯，Isoprene）碳骨架為基本單元的碳?xì)浠衔锛捌溲苌?，其起源于前體物質(zhì)異戊烯基焦磷酸（Isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（Dimethylallyl diphosphate，DMAPP）［20］。IPP和DMAPP在不同生物體內(nèi)涉及兩種不同的途徑：在大多數(shù)原核生物和植物細(xì)胞質(zhì)體中，這些化合物通過(guò)甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-Derythritol 4-phosphate，MEP）途徑產(chǎn)生（圖1-A），而在大多數(shù)真核生物、古細(xì)菌和某些原核生物（具有核心類異戊二烯途徑模塊）中，其通過(guò)甲羥戊酸（Mevalonate，MVA）途徑產(chǎn)生（圖1-B）［21］。

前體在代謝工程中是一個(gè)關(guān)鍵的限制因素，增加異戊二烯的前體供應(yīng)可以提高萜類化合物的產(chǎn)量。基于釀酒酵母內(nèi)源的甲羥戊酸途徑，增加前體DMAPP和IPP供應(yīng)的傳統(tǒng)策略是優(yōu)化MVA途徑相關(guān)酶（圖1-B）［22］。早期研究表明，MVA途徑中大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因（ERG10、ERG13、HMGR、ERG12、ERG8、IDI1和ERG20）的過(guò)度表達(dá)，都可以增加萜類化合物的產(chǎn)量［23］。此外，HMG1的N端截短版本（tHMG1）的過(guò)表達(dá)可催化其蛋白C端定位于細(xì)胞質(zhì)，從而解除法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）的反饋抑制，可顯著增加角鯊烯的生產(chǎn)［24-25］。這種截短修飾被廣泛應(yīng)用于萜類化合物的生產(chǎn)，例如檀香烯的生產(chǎn)［26］。組合設(shè)計(jì)是求解復(fù)雜代謝途徑最優(yōu)解的有效策略。Song等［27］結(jié)合啟動(dòng)子、整合拷貝數(shù)、染色體整合位點(diǎn)等因素，對(duì)于MVA途徑關(guān)鍵酶進(jìn)行組合洗牌優(yōu)化，可使香葉基香葉醇的產(chǎn)量提高至1 315.44 mg/L。

除了內(nèi)源的MVA途徑，也有研究將異源的異戊二烯前體途徑引入釀酒酵母基因組中［28］。由于NADH需要氧氣氧化來(lái)維持氧化還原狀態(tài)，而MEP途徑不會(huì)產(chǎn)生額外的NADH，因此導(dǎo)入異源MEP途徑相關(guān)酶（DXS、IspC～H等基因）的工程酵母能夠在低曝氣條件下僅依靠MEP途徑而不是MVA途徑來(lái)合成萜類化合物（圖1-A）［29］。將帶有線粒體靶向信號(hào)序列的MVA途徑基因整合到釀酒酵母基因組中，構(gòu)建得到具有天然的胞質(zhì)MVA途徑和工程的外源線粒體MVA途徑的釀酒酵母底盤細(xì)胞，其可以同時(shí)利用胞質(zhì)和線粒體乙酰輔酶A，可使工程酵母中異戊二烯的產(chǎn)量提升至2.5 g/L（圖1-C）［30］。

圖1 萜類化合物的生物合成的前體途徑優(yōu)化策略

2 提高乙酰輔酶A利用率的中心碳代謝研究進(jìn)展

在酵母中，乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）連接了中心碳代謝與甲羥戊酸途徑，是萜類化合物合成的重要代謝節(jié)點(diǎn)。酵母中的乙酰輔酶A合成途徑較為復(fù)雜，主要分為兩個(gè)部分：細(xì)胞質(zhì)中的乙酰輔酶A通過(guò)糖的分解代謝生成，其中涉及的酶為PDH旁路中的乙醛脫氫酶（ALD6）、乙酰輔酶A合成酶（ACS）及丙酮酸脫氫酶（PDC）；線粒體中的乙酰輔酶A通過(guò)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（PDHC）產(chǎn)生，該途徑為細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A的主要合成途徑。不同細(xì)胞器間生成的乙酰輔酶A沒(méi)有直接轉(zhuǎn)運(yùn)［31］。針對(duì)PDH旁路，過(guò)量表達(dá)乙醛脫氫酶（ALD6）、乙酰輔酶A合成酶（ACS）以及丙酮酸脫羧酶（PDC）是在酵母中增加乙酰輔酶A供應(yīng)的傳統(tǒng)策略（圖2-A），通過(guò)此策略可顯著提高紫穗槐二烯的產(chǎn)量［32］。

真核細(xì)胞的代謝被劃分在不同的亞細(xì)胞器中，不同細(xì)胞器合成的乙酰輔酶A不能透膜，乙酰輔酶A主要在線粒體中通過(guò)PDHC復(fù)合體產(chǎn)生，但目標(biāo)代謝產(chǎn)物的生物合成通常在細(xì)胞溶膠中進(jìn)行。因此將線粒體中的PDHC復(fù)合體重建至胞漿具有重要意義（圖1-B），可以在不積累副產(chǎn)物乙醇、不依賴ATP的情況下增加胞內(nèi)乙酰輔酶A的供應(yīng)［33］。然而，由于PDHC復(fù)合體亞單位活化輔因子硫辛酸的生物合成定位于線粒體，PDHC復(fù)合體在胞漿中的重建具有挑戰(zhàn)性［34］。

圖2 乙酰輔酶A的中央碳代謝優(yōu)化策略

研究表明，天然乙酰輔酶A合成酶（ACS1、ACS2）對(duì)ATP的需求限制了MVA途徑下游產(chǎn)物的產(chǎn)量［33］。一項(xiàng)對(duì)途徑化學(xué)計(jì)量、自由能供應(yīng)和氧化還原平衡的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)含有ATP依賴與ATP不依賴相關(guān)酶的乙酰輔酶A合成路線耦合時(shí)，法尼烯的理論產(chǎn)率最高［35］。然而，要實(shí)現(xiàn)乙酰輔酶A合成在這兩條途徑之間的精確分布，需要先進(jìn)的合成生物學(xué)工具來(lái)平衡酶的相對(duì)表達(dá)水平和代謝通量?；仡櫧甑暮铣缮飳W(xué)進(jìn)展，該設(shè)想已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。Meadows等［36］結(jié)合幾種策略來(lái)提高M(jìn)VA途徑的能量效率并降低細(xì)胞需氧量，最終使釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生了體積分?jǐn)?shù)為15%的法尼烯。這些策略（圖1-C）包括異源表達(dá)5-磷酸木酮糖（X5P）特異性磷酸酮醇酶（xPK）和磷酸轉(zhuǎn)乙酰化酶（PTA），打通從X5P到乙酰輔酶A的通路，減少糖酵解帶來(lái)的碳損失；異源表達(dá)乙醛脫氫酶（ADA），降低ATP需求；通過(guò)敲除內(nèi)源RHR2等基因，下調(diào)細(xì)胞原有PDH旁路流量。這種人工構(gòu)建的非天然途徑將碳利用率（葡萄糖轉(zhuǎn)化為萜烯的比例）提高了20%，氧氣利用率提高至驚人的280%，使萜烯的工業(yè)生產(chǎn)成本大大降低，商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)變得可能。這也預(yù)示著中央碳代謝工程正處于一個(gè)高度活躍的領(lǐng)域，仍有許多針對(duì)于此的遺傳修飾可以嘗試，增加MVA途徑通量的潛力巨大。

3 平衡競(jìng)爭(zhēng)途徑

3.1 在C15節(jié)點(diǎn)上控制MVA路徑競(jìng)爭(zhēng)

酵母MVA途徑提供了幾種重要代謝物質(zhì)，例如麥角固醇、泛醌、法尼醇、血紅素A、多氫酚等［37］。其中麥角固醇由鯊烯合酶（ERG9）將兩個(gè)C15法尼基焦磷酸（FPP）分子縮合得到。由于青蒿素和法尼烯等C15類異戊二烯產(chǎn)品也需要FPP作為前體，目標(biāo)C15代謝產(chǎn)物合成與細(xì)胞自身生長(zhǎng)所需代謝產(chǎn)物合成之間存在直接競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系［38］。通過(guò)更換啟動(dòng)子（替換為MET3p或CRT3p啟動(dòng)子）下調(diào)鯊烯合酶的表達(dá)，可以減少FPP向甾醇路徑的通量（圖3-A）［39］；通過(guò)將蛋白質(zhì)降解標(biāo)簽附著到角鯊烯合酶的C端，也可以成功地下調(diào)甾醇表達(dá)，該方法使奈洛哌啶醇的滴度提高86%，產(chǎn)量達(dá)100 mg/L［40］。通過(guò)dCas9靶向MVA途徑的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控相關(guān)途徑酶的活化或抑制，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的精細(xì)調(diào)節(jié)，從而控制通量流向，使得目標(biāo)產(chǎn)物胡蘿卜素的產(chǎn)量得到提升［41］。其他基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)控方法也已證明可用于控制酵母生長(zhǎng)與生產(chǎn)之間的競(jìng)爭(zhēng)，但尚未應(yīng)用于類異戊二烯合成。例如，合成群體感應(yīng)［42］、RNA干擾［43］、合成雜交啟動(dòng)子［44］、合成應(yīng)激反應(yīng)啟動(dòng)子［45］、合成mRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)和核糖開關(guān)［46］，以上策略都具有MVA途徑中的通量重定向潛力。

3.2 C10和C20的異戊二烯磷酸代謝

C10單萜具有多種用途，可作為香料和高級(jí)生物燃料。由于MVA途徑中沒(méi)有專用的C10前體合酶，天然通量都被“聚集”到C15的生產(chǎn)中。天然酵母FPP合酶（ERG20）是一個(gè)雙功能酶，它催化C5異構(gòu)體IPP和DMAPP縮合產(chǎn)生C10前體牻牛兒基焦磷酸（Geranyl diphosphate，GPP），同時(shí)GPP與IPP縮合生成C15前體FPP。ERG20的催化作用不會(huì)在GPP生成之后停止，導(dǎo)致GPP無(wú)法積累；同時(shí)FPP又是生物體內(nèi)必不可少的前體物質(zhì)，因此傳統(tǒng)的通量重定向技術(shù)（例如基因敲除）是不可行的。為克服該問(wèn)題，Ignea等［47］使用各種蛋白質(zhì)工程技術(shù)成功地將天然FPP合酶（Erg20p）轉(zhuǎn)化為GPP合酶（Erg20pF96W-N127W），使檜萜的產(chǎn)量增加了340倍（圖3-B）。重要的是，工程改造的FPP合酶保留了低水平的FPP合成能力，使其具備麥角甾醇合成能力以支持細(xì)胞生長(zhǎng)。將蛋白質(zhì)降解標(biāo)簽K3K15與ERG20蛋白融合，同時(shí)結(jié)合甾醇應(yīng)答啟動(dòng)子進(jìn)行動(dòng)態(tài)反饋調(diào)節(jié)，可使芳樟醇的產(chǎn)量提高27倍（圖3-C）［48］。通過(guò)引入異源橙花基焦磷酸（Neryl diphosphate，NPP）合成酶，構(gòu)建單萜化合物正交合成途徑，可以在不阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)的情況下高水平生產(chǎn)單萜（圖3-D）［34］。Cheng等［49］提出了工程化正交檸檬烯生物合成（OLB）途徑的策略，該策略組合NPP合成酶、以NPP為底物的檸檬烯合成酶，在酵母中實(shí)現(xiàn)了檸檬烯的高效合成。Ignea等［50］在釀酒酵母中引入西紅柿來(lái)源的橙花基二磷酸合酶（NPPS）合成NPP，替換原始前體GPP，構(gòu)建酵母萜類化合物正交網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)鑒定決定單萜合酶中的異構(gòu)底物選擇性的單一殘基F571，對(duì)5種不同的單萜合酶進(jìn)行改造，以更高的速率與特異性接受替代底物NPP，實(shí)現(xiàn)了單萜化合物的高效合成。

C20二萜可形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的分子，例如抗癌藥前體紫杉二烯［51］和香紫蘇醇等［52］。盡管酵母中有內(nèi)源性香葉基焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate，GGPP）合酶（BTS1）生成C20前體，但它不能與ERG9和ERG20蛋白的催化作用進(jìn)行有效競(jìng)爭(zhēng)，這意味著GGPP庫(kù)的通量相對(duì)較小。Ignea等［52］通過(guò)氨基酸替換的方法對(duì)ERG20中同源區(qū)域的活性位點(diǎn)進(jìn)行逆向進(jìn)化，從而將FPP合酶（Erg20p）轉(zhuǎn)化為GGPP合酶（Erg20pF96C），實(shí)現(xiàn)了二萜化合物的工業(yè)化生產(chǎn)（圖3-E）。

圖3 競(jìng)爭(zhēng)路徑平衡策略

4 細(xì)胞色素P450酶介導(dǎo)的萜類合成

類異戊二烯的合成生物學(xué)的另一個(gè)新興領(lǐng)域是通過(guò)細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的氧化修飾反應(yīng)生產(chǎn)復(fù)雜萜類化合物（例如抗瘧藥青蒿素、抗癌藥紫杉醇和抗癌/抗炎化合物丹參酮等）［53-54］。P450可催化多種氧化反應(yīng)，包括向sp3雜化的碳原子引入氧原子、C=C雙鍵的環(huán)氧化、氮氧化、脫胺、脫鹵和脫烷基化。此外，P450還可以催化特殊的重排反應(yīng)以及C-C鍵的斷裂等其他反應(yīng)［55］。

與大腸桿菌相比，酵母作為萜類化合物的合成生物學(xué)“底盤細(xì)胞”，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗骖櫫苏婧讼到y(tǒng)的功能性表達(dá)體系（可以表達(dá)復(fù)雜的真核蛋白，如細(xì)胞色素P450）和大規(guī)模微生物發(fā)酵的固有優(yōu)勢(shì)。目前，釀酒酵母已經(jīng)成功表達(dá)多種具有功能活性的植物來(lái)源的P450［56］。青蒿素在釀酒酵母中的半合成可以追溯到2006年［57］，首先通過(guò)導(dǎo)入黃花苜蓿中的紫穗槐二烯合酶（ADS）、紫穗槐二烯氧化酶（細(xì)胞色素P450酶，CYP71AV1）及其同源還原酶（CPR1）至釀酒酵母中，合成得到高達(dá)100 mg/mL青蒿酸［58］。然而。前體紫穗槐二烯在酵母中的表達(dá)量（150 mg/L）與大腸桿菌（25 g/L）相比很低［13］，紫穗槐二烯轉(zhuǎn)化為青蒿酸的能力也很差［53］。研究表明，高水平的青蒿酸生產(chǎn)與CYP71AV1及其同源還原酶的表達(dá)并非顯著相關(guān)，而是需要另外3種植物酶CYB5、ADH1和ALDH1的聯(lián)合表達(dá)來(lái)提高產(chǎn)率。此外，CYP71AV1：CPR1的表達(dá)比例也很關(guān)鍵，通過(guò)降低CPR1的表達(dá)，優(yōu)化CYP71AV1：CPR1的表達(dá)比例，可實(shí)現(xiàn)青蒿酸的高水平生產(chǎn)（圖4-A），其在2 L發(fā)酵罐中產(chǎn)量高達(dá)25 g/L［12］。

實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的紫穗槐二烯和青蒿酸生物合成的工作在2008年完成［12，23］，而隨著青蒿酸轉(zhuǎn)化為青蒿素的化學(xué)工藝開發(fā)，青蒿素的商業(yè)化生產(chǎn)也于2013年實(shí)現(xiàn)［13，59］。合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得研究者對(duì)P450酶的酶學(xué)信息的理解更加深入，打破了P450酶在微生物宿主中催化效率低、專一性差等困境，使得微生物高效合成復(fù)雜萜類化合物成為可能。此外，應(yīng)用其他來(lái)源細(xì)胞色素P450合成高價(jià)值萜類化合物也是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。例如，在酵母中引入大戟和麻瘋樹來(lái)源基因ElC9OX1和JcC5OX2與ADH共表達(dá)，可促進(jìn)千金二萜烷重要前體Jolkinol C的生物合成（圖4-C）［60］。通過(guò)進(jìn)化樹分析，鑒定得到纈草中纈草酸合成所需P450酶VoCYP71DJ1，將其引入甲羥戊酸高表達(dá)的酵母菌株中，同時(shí)異源表達(dá)黃花蒿來(lái)源的脫氫酶AaADH1和AaALDH1，可成功合成倍半萜纈草酸（圖4-B）［61］。Grewal等［62］通過(guò)在酵母中異源表達(dá)P450酶CYP76AD1W13L、MjDOD、Mj-cDOPA5GT構(gòu)建得到甜菜堿生物全合成通路，效價(jià)為17 mg/ L（顯色強(qiáng)度與10 g/L甜菜根提取物相對(duì)應(yīng)），并可通過(guò)喂養(yǎng)不同的氨基酸使其呈現(xiàn)不同顏色。Sun等［63］通過(guò)計(jì)算機(jī)建模識(shí)別分析以及實(shí)驗(yàn)改造來(lái)源于植物的P450單加氧酶CYP72A63中影響其化學(xué)和區(qū)域選擇性的關(guān)鍵殘基，從而改變其催化特性，實(shí)現(xiàn)了4種稀有甘草三萜化合物的特異性合成。Dai等［64］通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析以及酵母代謝工程平臺(tái)篩選得到了一種來(lái)源于植物山楂果實(shí)的P450氧化酶CYP716C49，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了酶具有廣泛的底物特異性，可用于五環(huán)三萜類化合物的C-2α位氧化。在迷迭香和一些鼠尾草物種的研究中，Bathe等［65］發(fā)現(xiàn)了兩組主要的細(xì)胞色素P450加氧酶，它們與松香烷二萜前體的氧化有關(guān)，其中CYP76AHs產(chǎn)生鐵銹醇和11-羥基鐵銹醇，而CYP76AKs在其C20位催化氧化；通過(guò)使用模塊化的Golden-Gate酵母表達(dá)組裝系統(tǒng)，系統(tǒng)地對(duì)這些酶進(jìn)行了單獨(dú)或組合的催化測(cè)試，共檢測(cè)到其催化產(chǎn)生了14種松香烷二萜，其中8種是目前為止尚未報(bào)道的新化合物。

圖4 細(xì)胞色素P450酶介導(dǎo)的復(fù)雜萜類化合物的生物合成

5 展望

近年來(lái)，合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展為微生物工廠生產(chǎn)高效、可持續(xù)的高價(jià)值萜類化合物開辟了新的機(jī)遇。合成生物學(xué)結(jié)合多個(gè)科學(xué)學(xué)科知識(shí)與工程學(xué)原理，將不同功能模塊引入適合大規(guī)模生產(chǎn)的微生物底盤細(xì)胞，擴(kuò)展了原有生物系統(tǒng)生產(chǎn)高價(jià)值萜類化合物的可能性。應(yīng)用合成生物學(xué)新工具與新方法，使得萜類化合物微生物合成的傳統(tǒng)策略重放異彩，創(chuàng)新成果也層出不窮：如異戊二烯前體途徑的優(yōu)化不再每次只針對(duì)一種酶，而是通過(guò)合成生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行組合優(yōu)化；細(xì)胞原有中央碳代謝的能量利用效率不高，則引入異源途徑進(jìn)行精密耦合；酶的定向進(jìn)化與修飾方法的成熟也顯著改善了目標(biāo)萜類化合物合成酶催化效率不高、專一性低等問(wèn)題，單萜二萜化合物的富集得以實(shí)現(xiàn)，復(fù)雜萜類化合物的異源細(xì)胞色素P450酶也得以高效表達(dá)。

盡管合成生物學(xué)還是一門年輕的學(xué)科，但隨著基因組裝、基因組編輯和數(shù)學(xué)建模技術(shù)的迅速發(fā)展，該領(lǐng)域正在迎來(lái)巨大的發(fā)展。這些進(jìn)展加速了天然產(chǎn)物復(fù)雜的代謝途徑在底盤細(xì)胞中的裝配過(guò)程，也縮短了合成生物學(xué)研究的設(shè)計(jì)-建造-測(cè)試周期。同時(shí)，釀酒酵母作為常用的微生物工業(yè)生產(chǎn)菌株，在高價(jià)值萜類化合物的生物合成上顯現(xiàn)出了巨大的潛力。在可預(yù)見(jiàn)的將來(lái)，釀酒酵母作為底盤細(xì)胞在高價(jià)值萜類化合物的生物合成工業(yè)上仍將保持其最前沿的位置。