張明亮 鄭小挺 薛 潔 馬 玲 姚文亮 熊 奇 陳勝輝

南昌市生殖醫(yī)院，江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬生殖醫(yī)院（江西南昌 330000）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展， 在眾多因素的影響下，不孕不育的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢， 而根據(jù)有關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，因男方因素引起的不孕不育約占一半[1]。 在過去，診斷男性不育癥主要依賴精子濃度、活動(dòng)率及精子形態(tài)學(xué)分析等參數(shù)，因其相應(yīng)診斷存在一定的局限性，臨床接診過程中仍有一部分不育患者難以確定不育原因， 普通的精液相關(guān)檢測無法反映男性生育力的真實(shí)水平。 因此，需要一個(gè)新的評估男性生育力指標(biāo)。 隨著精子DNA 碎片檢測的出現(xiàn)， 精子DNA 結(jié)構(gòu)的損傷引起男性不育受到生殖界的關(guān)注。有學(xué)者提出DNA 結(jié)構(gòu)高度完整的精子對于成功受精和維持正常的胚胎發(fā)育是必需的[2]。精子自身沒有DNA 修復(fù)機(jī)制，而染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性是正常受精、胚胎發(fā)育與妊娠的前提條件[3，4]。研究報(bào)道，精子DNA 損傷是精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常的一個(gè)重要特征，是造成男性不育、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)以及ART 治療失敗的重要原因之一[5，6]。重度少精子癥患者往往選擇卵泡漿內(nèi)單精子注射（ICSI）助孕治療，學(xué)者認(rèn)為伴有高DNA 碎片化（DNA fragmentation index，DFI）可能會(huì)對患者助孕的臨床結(jié)局有一定的影響， 同時(shí)也增加了攜帶有缺陷的基因的精子進(jìn)行受孕的機(jī)會(huì)， 高DFI 精子直接注射到卵細(xì)胞的胞漿內(nèi)，導(dǎo)致受精率、胚胎率及流產(chǎn)率等影響。 基于上述理論，重度少、弱精子伴有高DFI 患者選擇精子的方式是臨床上關(guān)注的重點(diǎn)，本研究擬觀察重度少、弱精子伴有高DFI 患者精液精子和睪丸精子行ICSI 助孕后臨床結(jié)局的比較，探討一種臨床結(jié)局較好的取精方式。

討 論

一、研究對象

選取南昌市附屬生殖醫(yī)院生殖男科門診2017 年4月至2018 年4 月行ICSI 助孕治療的82 例患者， 其中有3 例患者因各種因素取消移植， 本研究納入標(biāo)準(zhǔn)：1）患者屬于重度少精子癥（＜500 萬/mL， 世界衛(wèi)生組織《WHO 人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》第五版）同時(shí)伴有精子DNA 碎片異常（DFI＞15%）；2）女方單純輸卵管因素，生育力評估基本正常，卵巢功能、宮腔環(huán)境良好及無免疫性疾??；3）男女雙方染色體正常，男性無外傷、無遺傳史，無性功能障礙及生殖系統(tǒng)感染等。

二、研究方法

（一）分組情況

將82 例患者按隨機(jī)分組法分為睪丸精子組42例： 在女方取卵當(dāng)日男方行睪丸顯微取精術(shù)（Microtesticular sperm extraction，M-TESE）， 將獲取的適量精子行ICSI 助孕；精液精子組40 例：在女方取卵當(dāng)日，男方在禁欲7 天內(nèi)行手淫取出新鮮精液送實(shí)驗(yàn)室處理后行ICSI 助孕； 兩組患者取精前和取精后分別檢測其精子DNA 碎片情況。

（二）精子、卵子標(biāo)本

1. 精子標(biāo)本：睪丸組精子獲取實(shí)行顯微取精術(shù)：全麻后在顯微鏡下沿著睪丸赤道線切開睪丸白膜， 暴露出曲細(xì)精管， 在高倍顯微鏡下選取較為飽滿粗大發(fā)亮的曲細(xì)精管，滴入適量的培養(yǎng)液，立即送往實(shí)驗(yàn)室，由實(shí)驗(yàn)室工作人員撕開曲細(xì)精管后， 在倒置的顯微鏡下發(fā)現(xiàn)適量活動(dòng)的精子備用； 精液組精子在禁欲7 天內(nèi)由患者手淫獲取新鮮精液送實(shí)驗(yàn)室檢測處理備用；

2. 卵子標(biāo)本： 納入標(biāo)準(zhǔn)的女方均采用改良超長方案促排卵， 在月經(jīng)周期第二天皮下注射醋酸亮丙瑞林微球(貝依)3.75mg，注射日開始計(jì)算，35 天后返院予以靜脈注射尿促卵泡素150～300IU 和尿促性腺激素75～150IU， 超聲發(fā)現(xiàn)當(dāng)有1 個(gè)卵泡直徑≥1.8cm 或2 個(gè)卵泡平均直徑≥1.7mm 時(shí)停止用藥，當(dāng)晚21 點(diǎn)肌注絨促性腺激素8000 單位，36～38h 后在陰道B 超引導(dǎo)下行取卵術(shù)，并記錄取卵情況和獲卵數(shù)。

（三）DFI 檢測

兩組患者囑咐禁欲7 天內(nèi)進(jìn)行取精， 流式細(xì)胞儀檢測DFI， 其中試劑盒購自浙江星博生物科技有限公司。 嚴(yán)格按照試劑說明標(biāo)準(zhǔn)化操作，在高倍顯微鏡下觀察500 個(gè)精子，記錄存在DNA 碎片精子的個(gè)數(shù)。 精子是否存在DNA 碎片的標(biāo)準(zhǔn):精子頭部僅產(chǎn)生較小光暈或無光暈， 單側(cè)光暈厚度不超過精子頭部最小直徑的1/3。 計(jì)算DFI（%）=存在DNA 碎片精子數(shù)/ 被觀察精子的總數(shù)×100%。

（四）ICSI 獲取精子和取卵后， 在倒置顯微鏡下利用顯微注射針將精子注射到卵泡漿內(nèi)， 觀察受精和評估胚胎情況。

（五）胚胎移植 所有受試患者均采取3 日齡卵裂胚移植，觀察移植后情況。

（六）臨床結(jié)局 記錄卵裂胚移植后12d，行血絨毛膜促性腺激素（human choionic gonadotophin，HCG）檢查，陽性者為生化妊娠，移植后5 周行B 超檢測，宮內(nèi)可見孕囊、胚芽及胎心者確診為臨床妊娠。

（七）觀察指標(biāo)

1.睪丸組M-TESE 后精子DNA 碎片變化情況；

2.兩組精子ICSI 后受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可用胚胎數(shù)、流產(chǎn)率和抱嬰率情況。

（八）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

兩組患者所涉及的數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，其中計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），并采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)計(jì)算，P值大于0.05 被認(rèn)為無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，反之具有明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、試驗(yàn)基本情況

本次試驗(yàn)共有82 例受試患者納入，在睪丸組和精液組的所有受試患者中， 試驗(yàn)周期內(nèi)患者因個(gè)人原因或其他原因未移植的，睪丸組2 例，精液組1 例，共3例患者， 均作剔除處理， 完成整個(gè)試驗(yàn)的， 治療組40例、對照組39 例。

二、兩組受試患者基本情況比較

其中兩組患者的年齡、不育年限、精子濃度及精子碎片情況比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，（P＞0.05），見表1。

表1 兩組基本情況對比

三、睪丸精子組患者睪丸取精前后精子碎片情況比較

其中睪丸獲取精子后再次檢測碎片發(fā)現(xiàn)精子碎片率明顯低于精液組精子， 對照組精液精子和治療組睪丸精子DFI 分別為27.55±4.78 和6.70±1.98，（P＜0.01）比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；

四、兩組患者ICSI 助孕后臨床結(jié)局對比，見表2。

表2 兩組患者受精和胚胎情況對比

五、兩組患者ICSI 助孕后臨床結(jié)局對比，見表3。

表3 兩組患者臨床結(jié)局對比

討 論

DFI 作為評估男性生育力的新指標(biāo)在ART 助孕中有著重要的指導(dǎo)意義，為男性不育的診療開拓了新的思路。 國內(nèi)外有研究表明DFI 與精液常規(guī)質(zhì)量、精子形態(tài)學(xué)等存在相關(guān)性[7-9]，也有研究認(rèn)為DFI＞30%影響不育及妊娠率， 當(dāng)DFI＞30%時(shí)ICSI 助孕可能是首選的助孕方法[10，11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)精子DFI 增高導(dǎo)致ICSI 助孕的生化妊娠率及流產(chǎn)率增高， 而對臨床妊娠率無明顯影響，而高DFI 精子行ICSI 助孕與體外受精（In Vitro Fertilization，IVF）助孕相比較，其臨床妊娠率和種植率明顯高于后者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對于高DFI 患者ICSI 可作為一種較好的助孕選擇方式[12，13]。 柳祖波等[14]研究報(bào)道探討725 例不孕夫婦病例中， 發(fā)現(xiàn)精子DNA 碎片對IVF結(jié)局基本無影響， 但與ICSI 結(jié)局中的可用胚胎率和優(yōu)質(zhì)胚胎率呈負(fù)相關(guān)，并認(rèn)為這可能與受精過程中IVF 周期中卵子對精子有自然選擇的過程， 而ICSI 周期中則是與人為的選擇精子有關(guān)。 也有Carlini T 等[15]針對意大利反復(fù)流產(chǎn)的夫婦研究中評估DFI 發(fā)現(xiàn)，男性精液DFI水平與不育組相似，高于正常生育組，但其認(rèn)為不能以單純的DFI 作為反復(fù)流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測指標(biāo)。 Oleszczuk K 等[16]研究認(rèn)為當(dāng)DFI 值＞40%以上，流產(chǎn)率會(huì)明顯上升， 其檢測可作為選擇ART 受精方式方法， 高碎片精子，選擇ICSI 可能會(huì)是更好的方法。 但上述結(jié)論尚未得到統(tǒng)一，目前的男性不育及ART 診療共識中，尚未納入適應(yīng)證范圍內(nèi)，目前仍未得到國際上一致認(rèn)可的結(jié)論。

而在少精子癥伴有高DFI 患者中， 有研究觀察發(fā)現(xiàn)其睪丸內(nèi)獲取的精子DFI 明顯低于射出精子， 研究中經(jīng)末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 鎳端標(biāo)記(TUNEL)法檢測的DFI 在射精時(shí)顯著高于睪丸精子，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， 認(rèn)為睪丸內(nèi)精子受到外界的損傷程度較小，也有研究認(rèn)為睪丸精子提取和ICSI 在高DFI 不育男性中具有協(xié)同作用， 睪丸精子注射ICSI 助孕后懷孕率明顯高于射精后ICSI 助孕[17，18]。而Ben-AmiI 等[19]研究17 例隱匿性精子癥伴有高碎片的患者中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用睪丸精子的分娩率明顯高于精液精子。 雖然在高DFI 患者中，有觀察發(fā)現(xiàn)使用ICSI 助孕比使用IVF 助孕后更容易受孕， 這可能與治療的人群和每種方法中使用精子處理技術(shù)的不同有關(guān)[20]。 有報(bào)道涉及2,969 對夫婦的薈萃分析中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DFI比例異常高的精液樣本被用于ICSI 時(shí)， 流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)增加了2.16 倍[21]。 這與我們的研究中的情況一致，結(jié)合本次研究數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，也驗(yàn)證了上述學(xué)者們的觀點(diǎn)，少精子癥伴有高DFI 患者中的睪丸獲取精子的DFI 明顯低于精液精子，而行ICSI 助孕后受精率對比無差異，但胚胎質(zhì)量和臨床結(jié)局等情況具有明顯差異。 數(shù)據(jù)顯示，精液精子組有較高的流產(chǎn)率，睪丸精子有較好的臨床結(jié)局。

有Ollero M,Alvarez JG 等學(xué)者[22，23]認(rèn)為DNA 損傷主要是睪丸后發(fā)生的事件，DNA 結(jié)構(gòu)的損傷可以在睪丸精子中發(fā)現(xiàn)，是因?yàn)橹苯訙p數(shù)分裂失敗或早期染色質(zhì)缺陷裝配， 但絕大多數(shù)的DNA 損傷是在射精中觀察到的。 故而驗(yàn)證了睪丸精子的DFI 要明顯低于精液精子。然而，隨著顯微外科的發(fā)展，在以往的非梗阻性無精子癥（non-obstructive azoospermia，NOA） 患 者 中 通 過M-TESE 獲取的精子行ICSI 助孕后產(chǎn)下的新生兒是安全可靠的，但這些數(shù)據(jù)僅涉及NOA 患者的收集，而在少精子癥伴有高DFI 患者中使用睪丸精子助孕需要持續(xù)的監(jiān)測，直到該選擇精子方法的安全可靠性得到認(rèn)可。

綜上所述，本次研究的結(jié)果表明，對重度少精子癥伴有高DFI 患者， 選擇睪丸精子助孕具有較好的臨床結(jié)局， 為臨床上高DFI 患者選擇ART 助孕技術(shù)以外，提供一種更為安全可靠的精子選擇方式。