許 麗 張時君 王鴻祥 杜 晶 李紅麗 盧慕峻 李鳳華

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院超聲醫(yī)學科（上海 200127）

無精子癥占男性不育的15%[1]，常根據(jù)輸精管道是否通暢分為梗阻性無精癥(obstructive azoospermia,OA)和非梗阻性無精癥(non-obstructive azoospermia,NOA)，兩者的鑒別診斷對臨床后續(xù)治療具有重大意義。 利用生物組織的彈性（或硬度）改變與病灶的生物學特性緊密相關(guān)的原理， 超聲彈性技術(shù)已廣泛用于乳腺、甲狀腺、肝臟等疾病的診斷[2-5]，但睪丸無精子癥方面的研究較少報道，尚處于探索階段。 本研究以男科顯微手術(shù)獲得組織病理學為“金標準”，旨在探討實時剪切波彈性成像(shear wave elastography，SWE，也稱E 成像) 定量分析結(jié)合睪丸體積在無精子癥鑒別診斷中的應(yīng)用價值，為無精子癥患者建立無創(chuàng)評估體系提供新方法。

資料與方法

一、臨床資料

回顧分析2017 年8 月24 日至2018 年8 月21 日就診于我院男科的男性不育患者， 根據(jù)WHO 男性不育診斷標準診斷為無精子癥。 所有患者均通過病史采集、臨床觸診、精液分析、精漿生化檢查、血清性激素測定、染色體及遺傳學檢查、經(jīng)陰囊及直腸超聲檢查睪丸和輸精管道，行睪丸顯微取精術(shù)（micro-TESE,microsurgical testicular sperm extraction）或輸精管附睪管端側(cè)顯微吻合術(shù)（VE,microsurgical vasoepididymostomy） 且術(shù)后病理證實為梗阻性或非梗阻性無精子癥。健康對照組選取期間至我院男科檢查證實睪丸發(fā)育良好、性激素水平正常、精液常規(guī)檢查正常（或已有生育史）、超聲檢查未發(fā)現(xiàn)泌尿系統(tǒng)疾病，自愿參加本研究患者。 排除標準：有睪丸腫瘤、急性睪丸炎、急性陰囊腫脹、大量鞘膜腔積液、三周內(nèi)行睪丸穿刺術(shù)患者除外。

二、儀器與方法

采用法國Supersonic 公司Aixplorer 實時二維剪切波彈性超聲診斷儀，SL15-4 探頭，頻率為4-15 MHz，彩色編碼范圍為0-50 kPa。 患者取平臥位， 充分暴露陰囊，陰莖輕輕上提，保證陰囊皮膚未受牽拉，先行常規(guī)超聲檢查， 測量睪丸體積大小， 按公式體積=長×寬×高×0.71 計算體積，陰囊表面涂充分的耦合劑，縱切顯示睪丸最大切面，微調(diào)整避開大血管及睪丸縱隔網(wǎng)，轉(zhuǎn)換到彈性成像，檢查過程中始終保持睪丸、探頭互相垂直，避免壓迫或移動睪丸。 如圖1 所示，彈性成像取樣框系統(tǒng)默認位于圖像中心位置， 范圍以盡量包含睪丸組織為宜（睪丸體積小于取樣框最大徑，則取樣框與睪丸外緣相切包含整個睪丸； 若睪丸體積大于取樣框最大徑， 則如圖1 所示取樣框優(yōu)先包含睪丸中心區(qū)域），靜置3s 待圖像穩(wěn)定后凍結(jié)圖像， 以圖像填充90%，且睪丸中心圖像填充相對均勻一致、無明顯偽像為成功，啟動Q-BOX 功能，以取樣框中心為圓點，以1/2 取樣框短徑（圖1 中距離為1.79 cm）為直徑選擇感興趣區(qū)（圖1 中測量取樣框直徑為9 mm）， 此時顯示Q-BOX 測量區(qū)域內(nèi)的楊氏模量平均值(Mean)、最大值(Max)、最小值(Min)以及標準差(SD)，同時顯示剪切波平均速度（m/s）。

所有患者由具有5 年男科超聲臨床經(jīng)驗的高年資醫(yī)師（操作者1）與有1 年男科超聲臨床經(jīng)驗的低年資醫(yī)師（操作者2）分別存儲3 幀圖并測量3 次，共計6次， 兩位操作者均于實驗前接受4 周的超聲彈性成像技術(shù)操作培訓。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析， 計數(shù)資料根據(jù)是否滿足方差齊性，年齡、體積以均值±標準差表示，彈性用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，參考值范圍以95%置信區(qū)間表示。 以組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intraclass correlation coefficient，ICC) 評價觀察者間信度與復(fù)測信度。 不同分組的楊氏模量值比較采用秩和檢驗，不同分組體積差異比較采用兩獨立樣本t 檢驗。體積或彈性亞組組內(nèi)差異比較采用卡方檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義（四組秩和檢驗兩兩比較時，P＜0.0125 為差異有統(tǒng)計學意義）。 應(yīng)用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic，ROC 曲線)分析取得最適合診斷臨界點，利用Medcalc 軟件比較ROC 曲線效能差異。

結(jié) 果

一、一般情況

本研究共收錄210 人，排除逆行射精2 人、急性睪丸炎2 人、 混合性無精子癥患者2 人、3 月內(nèi)有穿刺史1 人、大量鞘膜腔積液3 人、彈性圖像獲取失敗15 人，入組對象共計185 人，其中正常志愿者32 人，根據(jù)顯微外科手術(shù)及術(shù)后病理證實，共58 例OA 患者，其中先天性雙側(cè)輸精管缺如（Congenital Bilateral Absence of the Vas Deferens,CBAVD）13 例，附睪炎性梗阻38 例，輸精管梗阻7 例；95 例NOA 患者， 因克氏癥特有的病理及硬度改變，單獨列為一組，共20 例；非克氏癥的NOA 病例構(gòu)成為Y 染色體AZF 微缺失4 例， 有隱睪下降固定病史5 例， 后天性睪丸炎3 例， 其他特發(fā)性NOA 共63 例，獲得上述無精子患者、正常志愿者的睪丸體積及SWE 圖像，楊氏模量值組內(nèi)信度檢測顯示操作者1 的ICC 為0.867，操作者2 的ICC 為0.836，表明信度良好， 兩位操作者彈性測值差異無統(tǒng)計學意義（P=0.231）。

圖1 正常志愿者睪丸縱切面SWE 圖像

二、不同分組睪丸楊氏模量值比較

因非梗阻性無精子癥（NOA）中克氏癥患者睪丸特有的硬度特點，本研究將NOA 分為克氏癥（KS NOA）和非克氏癥（Non-KS NOA）兩個亞組，不同分組間年齡、睪丸體積及睪丸彈性值見表1，各組間年齡無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），正常、OA、Non-KS NOA 及KS NOA組睪丸楊氏模量中位數(shù)（單位kPa）分別為1.8(1.6-2.0)、1.8(1.6-2.1)、1.6(1.2-1.8)和2.5(1.9-3.0)，KS NOA 組患者睪丸彈性高于正常組、OA 組和Non-KS NOA 組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001），OA 組高于非克氏癥的NOA 組（P=0.007）與正常組比較無明顯差異（P=0.7），非克氏癥的NOA 組低于正常組（P=0.002）。

表1 不同分組睪丸體積及楊氏模量表

三、睪丸彈性聯(lián)合體積鑒別價值探討

如圖2 所示，利用ROC 曲線得出楊氏模量值診斷OA 和Non-KS NOA 患者的曲線下面積Az=0.681(0.618-0.745)，最佳截斷值為1.7 kPa，以楊氏模量值≥1.7 kPa 診斷為OA 為標準， 敏感度=61.3%， 特異度=68.7%，約登指數(shù)=0.3。 利用體積鑒別OA 和Non-KS NOA 患者時，ROC 曲線下面積Az=0.886(0.849-0.923)，最佳截斷值為12 ml， 以體積≥1.2 ml 診斷為OA 為標準，敏感度=78.2%，特異度為81.3%，約登指數(shù)=0.595。睪丸體積的鑒別診斷能力高于睪丸楊氏模量值（P=0.000）。 睪丸體積和楊氏模量值聯(lián)合診斷OA 和Non-KS NOA 患者，曲線下面積為Az=0.890(0.853-0.927)，效能優(yōu)于單一楊氏模量值（P=0.000），但與睪丸體積診斷效能無明顯差異（P=0.465），以體積≥1.2 ml，且彈性值≥1.7 kPa 診斷為OA 為標準，敏感度=83.4%，特異度=81.9%，約登指數(shù)=0.653。

利用睪丸楊氏模量值及體積聯(lián)合鑒別OA 及KS NOA， 結(jié)果示兩者聯(lián)合曲線下面積優(yōu)于楊氏模量值（1.000 vs 0.799，P=0.001） 與體積無統(tǒng)計學差異（1.000 vs 0.996，P=0.201）, 以體積≤3.6ml， 且彈性值≥2.3kpa診斷為KS NOA 為標準， 敏感度=99.16%， 特異度=100%，約登指數(shù)=0.99。

圖2 睪丸體積、楊氏模量值及兩個聯(lián)合鑒別梗阻及非克氏癥非梗阻患者的的ROC 曲線

為了進一步探討彈性和體積的聯(lián)合價值， 本研究將OA 及NOA 患者睪丸體積細化為5 組（如表2 所示）， 結(jié)果示在5 個亞組中，1，2，4，5 組中OA 及NOA間體積均有統(tǒng)計學差異（P=0.000）， 當睪丸體積小于10.0 ml 時，89.5%的患者是NOA 患者； 當睪丸體積大于等于12 ml 時，78.3%的患者是OA 患者。但睪丸體積在10.1-12.0 ml 區(qū)間內(nèi)時，OA 及NOA 患者存在較大重疊，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.612），我們比較此區(qū)間兩組患者的睪丸楊氏模量，發(fā)現(xiàn)OA 組彈性值高于NOA 組患者（P=0.001），曲線下面積AUC 是0.788（0.655-0.921），以彈性值≥1.7 kPa 為OA 作為判定標準， 其敏感性為80%，特異性為62%，約登指數(shù)為0.409。如圖3 所示，A 無精子癥患者睪丸體積為10.2 ml（圖A1），在10.1-12.0 ml區(qū)間，彈性楊氏模量值為1.8 kPa（圖A2），最終手術(shù)和病理證實為梗阻性無精子癥；B 無精子癥患者體積11.9 ml（圖B1）, 彈性楊氏模量值為1.3 kPa（圖B2），最終手術(shù)和病理證實為非梗阻性無精子癥。 可見，在睪丸體積無法區(qū)分OA 和NOA 患者時，睪丸彈性值可以進行補充診斷。

另一方面， 本研究也將OA 和NOA 患者睪丸楊氏模量值細化為4 組，如表2 所示，可見第1,3,4 分組中，彈性對無精子癥有鑒別價值， 當彈性≤1.2 kPa 時，88%的患者為NOA 患者，當彈性≥2.5 kPa 時，82.5%的患者為NOA 患者，主要為克氏癥患者，當彈性介于1.3-1.7 kPa時，OA 和NOA 患者存在較大重疊,差異無統(tǒng)計學意義（P=0.325）。 但此區(qū)間內(nèi)OA 患者睪丸體積遠大于NOA患者睪丸體積（P=0.000），從而提高鑒別診斷價值。

表2 梗阻性及非梗阻性無精子癥患者睪丸楊氏模量及體積分布

圖3 睪丸體積介于10.1-12.0 mL 的OA（A）及NOA 患者的睪丸灰階圖（A1,B1）、睪丸E 成像圖（A2,B2）

討 論

不育不孕癥作為生殖系統(tǒng)疾病影響著全世界約15%的人群[6]，其中與男性因素相關(guān)者占50%[7]，男性不育病因復(fù)雜，無精子癥是其中尤為嚴重的情況[8]。 以往附睪穿刺及睪丸活檢的病理學檢查多是梗阻及非梗阻無精子鑒別診斷的金標準， 但睪丸本身的生精狀況不完全均衡，生精可呈局灶性，同時睪丸/ 附睪活檢位置選擇的隨機性很大，受手術(shù)者手法影響，組織獲取情況無法保證。 隨著顯微外科技術(shù)的發(fā)展，睪丸顯微取精術(shù)及輸精管附睪管端側(cè)吻合術(shù)作為無精子癥患者的治療手段，展示出創(chuàng)傷小，精子獲得率高、可全面準確的評估鑒別無精子癥病因等諸多優(yōu)勢[9,10]。 本研究以顯微外科手術(shù)結(jié)果及術(shù)后病理進行無精子癥的分組及回顧分析，比以往研究[10-12]有更加可靠的診斷“金標準”。

超聲彈性成像是一項新技術(shù)， 主要有位移或應(yīng)變成像、 點式剪切波測量及實時剪切波彈性成像（E 成像），有望通過探測睪丸組織各區(qū)域的不同硬度來評價睪丸生精功能[13]。本課題組前期評估了應(yīng)變彈性成像在鑒別無精子癥中的價值， 表明睪丸彈性硬度值可以對OA 及NOA 有鑒別能力， 且對無精子癥的病理分型有一定預(yù)測作用[14,15]。 但應(yīng)變彈性技術(shù)需要對探頭施加壓力， 彈性圖像定性分級受到操作者手法及主觀因素影響較大，重復(fù)性欠佳。 E 成像作為一種最新進展的彈性量化技術(shù)，采用“馬赫圓錐”原理，可以獲得組織定量楊氏模量值，不受主觀因素的影響，其次不需要對探頭施加壓力， 避免不同操作者間的操作誤差， 可重復(fù)性較好，研究表明[12,17]E 成像在睪丸組織硬度測量中可有較好的可行性及應(yīng)用性， 可用于各類睪丸疾病的硬度測量及評估。

本研究結(jié)果顯示， 不同操作者間楊氏模量的測值穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，非梗阻無精子癥中克氏癥患者的睪丸楊氏模量值高于正常、 梗阻及其他非梗阻患者（P=0.001），OA 組高于Non-KS NOA 組， 這與Rocher等人[12]的研究趨勢一致。推測原因是克氏癥的病理基礎(chǔ)為睪丸間質(zhì)增生、基底膜增厚，生精小管玻璃樣變導(dǎo)致睪丸硬度增加[18]。非克氏癥的非梗阻性患者睪丸彈性值低于梗阻性及正?；颊?，這與其睪丸體積小、精子發(fā)生低下、生精小管管腔窄、上皮組織薄導(dǎo)致睪丸不飽滿而較軟有關(guān)。

有研究表明， 睪丸體積大小與睪丸生精功能直接相關(guān)，有助于初步判斷男性生育狀態(tài)[19]，對鑒別無精子癥類型有一定價值。 本研究中， 當睪丸體積小于10ml時，89.5%的患者是非梗阻性無精子癥的患者； 當睪丸體積大于等于12ml 時，78.3%的患者是梗阻性無精子癥的患者，根據(jù)ROC 曲線分析，睪丸體積對無精子癥的鑒別能力優(yōu)于睪丸楊氏模量（P=0.000），這可能與睪丸楊氏模量值較小，各組測值重疊區(qū)域較大有關(guān)。

本研究通過細化睪丸體積及彈性的分組， 具體探討了睪丸體積和彈性聯(lián)合的最優(yōu)條件。 在睪丸體積為10.1-12.0 mL 時無法有效的對梗阻和非梗阻進行鑒別，此時睪丸彈性值對梗阻和非梗阻起到很好的補充鑒別作用，同樣在彈性值無法鑒別的亞組（1.3-1.7kPa），同時結(jié)合睪丸體積可以做出有效判斷。

綜上所述，E 成像檢測睪丸組織彈性硬度穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，可以對無精子癥進行鑒別診斷，但單獨E成像楊氏模量值的鑒別效能要低于睪丸體積。 細化睪丸體積及E 成像分組，也成功的發(fā)現(xiàn)在單一體積或彈性無法鑒別時， 聯(lián)合另一參數(shù)睪丸體積就可以很好的互補，提高鑒別診斷能力。 本研究以手術(shù)探查及組織病理學為金標準，對E 成像應(yīng)用于無精子癥鑒別診斷作出客觀初步探究，有利于完整可靠診斷體系的建立，以期更好地服務(wù)于無精子癥患者早期無創(chuàng)的超聲鑒別診斷。