蔡 濱 金保方 孫大林 鄧偉民

東南大學附屬中大醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合男科（江蘇南京 210009）

精子發(fā)生是一個高度協(xié)調(diào)、有序進行的過程，精原干細胞（spermatogonia stem cells，SSCs）的自我更新與分化是精子發(fā)生的基礎[1]。 SSCs 通過源源不斷地增殖為精子發(fā)生提供穩(wěn)定的原料， 而細胞周期的準確調(diào)控對SSCs 的增殖具有決定性作用[2]。 細胞周期蛋白（cyclin）通過與相應的細胞周期蛋白依賴激酶（cyclin dependent kinase，CDK）結(jié)合形成具有蛋白激酶活性的異源二聚體復合物，推動細胞周期各時相的有序進行。 研究表明，PI3K-Akt-Cyclin D 通路在SSCs 的增殖中扮演重要角色， 一些細胞因子如膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）可以通過磷脂酰肌醇3- 激酶 (phosphatidylinositol 3-kinaseA，PI3K)/ 蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）通路促進Cyclin D 的表達，進而促進SSCs 的增殖[3-5]。

養(yǎng)精膠囊（Yangjiing Capsule，YC）是我們在臨床上常用的方劑，用于治療由少弱精子癥導致的男性不育，療效確切。 為此，我們進行了一系列基礎研究，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)精膠囊作用于小鼠SSCs 48 h 后，細胞周期中S 期細胞比例明顯增加，說明養(yǎng)精膠囊能夠促進小鼠SSCs 由G1期向S 期的過渡，進而促進細胞增殖[6]。 進一步研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)精膠囊可以與GDNF 的受體（GDNF family receptor alpha-1）結(jié)合，通過PI3K-Akt 通路，促進小鼠SSCs增殖[7]，但其下游的機制不清。

鑒于Cyclin D 在SSCs 增殖中的重要作用，我們猜測養(yǎng)精膠囊可能通過PI3K-Akt 通路作用于Cyclin D發(fā)揮作用。 因此，本研究的目的是研究養(yǎng)精膠囊是否通過PI3K-Akt 通路促進Cyclin D 的表達，進而促進SSCs的增殖。

材料與方法

一、細胞分離及培養(yǎng)

取4～6 d 雄性BALB/c 小鼠的睪丸，運用改良的兩步消化法和差速貼壁分選獲得高度純化的SSCs， 種植到小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上，每2 d 更換培養(yǎng)液1次。 具體步驟見參考文獻[8]。

二、主要試劑與藥品

CCK-8 試劑盒、細胞周期試劑盒、細胞裂解及蛋白抽提試劑盒、Western 檢測相關試劑、LY294002（PI3K抑制劑）（碧云天，中國）；細胞總RNA 提取試劑（Trizol法）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR 檢測試劑盒（諾唯贊，中國）；重組小鼠GDNF（Pepro Tech，美國）；兔抗鼠Cyclin D1 抗體（ab16663）、兔抗鼠Cyclin D2 抗體（ab230883），兔抗鼠Cyclin D3 抗體（ab112034）（Abcam，美國）；兔抗鼠Akt 抗 體（4685S）、 兔 抗 鼠p-Akt 抗 體（Ser473，4060S），兔抗鼠β-actin 抗體（4970S）（CST，美國）；養(yǎng)精膠囊由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科生產(chǎn)提供[院臨（2004）第01002 號]。 養(yǎng)精膠囊水提物提取方法見參考文獻[7]。

三、細胞阻斷實驗

委托上海捷瑞生物工程有限公司設計針對Cyclin D1 基因的干擾RNA（siRNA）序列，同時設計一條陰性對照（siRNA-NC）序列，通過BLAST 驗證該序列對于其他基因無干擾效果：

轉(zhuǎn)染siRNA-Cyclin D1 之前先將SSCs 以1×105/孔接種至六孔板中，待細胞長至60%密度時采用Lipofectamine 3000（Invitrogen，美國）將siRNA-Cyclin D1/siRNA-NC 轉(zhuǎn)染進細胞，37 ℃孵育24 h 后加入養(yǎng)精膠囊提取液繼續(xù)培養(yǎng)48 h 進行后續(xù)檢測。

采用LY294002 進行PI3K 阻斷實驗，SSCs 以1×105/孔接種至六孔板中，將25 μM 的LY294002 預先加入六孔板中培養(yǎng)2 h，之后加入養(yǎng)精膠囊提取液繼續(xù)培養(yǎng)48 h 進行后續(xù)檢測。

四、細胞增殖檢測

在96 孔板中以4×103/ 孔的密度接種細胞懸液，放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h， 不同實驗組處理后向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液， 然后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度。 細胞增殖率=[(實驗孔吸光度- 空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

五、細胞周期檢測

處理后的細胞在冰浴預冷的70%乙醇中重懸，4℃固定過夜。1000 g 左右離心3 min 沉淀細胞，之后加入冰浴預冷的PBS 重懸細胞， 每管細胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色復合液，37 ℃避光溫浴30 min。 然后使用FACScan 流式細胞儀對樣本進行分析， 采用ModFit LT 3.0 軟件評價G0/G1期、S 期、G2/M 期細胞百分比。

六、實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）

處理后的細胞用Trizol 試劑提取總RNA， 之后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA 為模版進行擴增，所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司并合成：

加樣體系按照定量PCR 檢測試劑盒說明進行操作，反應采用標準的兩步法：95 ℃1 min，1 個循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個循環(huán)，采用溶解曲線是判斷擴增產(chǎn)物是否單一，采用2-△△Ct法計算表達量的相對比值。

七、蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot，WB）

使用裂解液裂解細胞，之后用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，確保每個蛋白樣品的上樣量為30 μg，電泳采用10%的SDS-PAGE 凝膠， 然后使用硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h， 加入Cyclin D1 抗體（1：1000）、Cyclin D2（1：1000）、Cyclin D3（1：1000）、β-actin抗體（1：2000）4 ℃過夜，TBST 洗膜后加HRP 標記的二抗（1：5000）室溫孵育，然后加顯影液曝光。

八、數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)都采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析。 各組計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示。 兩組定量數(shù)據(jù)的比較：若正態(tài)分布，采用two-tailed Student’s t-test 分析；若非正態(tài)分布，采用Mann-Whitney U 檢驗。P＜0.05 認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、養(yǎng)精膠囊促進SSCs 增殖，促進細胞由G1 期向S 期轉(zhuǎn)化

圖1A 表明，0.01、0.1、1 mg/mL 濃度 的 養(yǎng)精 膠 囊在24、36、48 h 這三個時間點的增殖活性與空白對照組相比有統(tǒng)計學差 異（P＜0.05，P＜0.01）， 而10 mg/mL 的養(yǎng)精膠囊與空白對照組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）， 表明過高濃度的養(yǎng)精膠囊對于小鼠SSCs的增殖可能有抑制作用， 因此， 后續(xù)實驗我們選用0.01、0.1、1 mg/mL 這三種濃度作為養(yǎng)精膠囊的低、中、高濃度進行。細胞周期結(jié)果（圖1B、圖1C）顯示養(yǎng)精膠囊（1 mg/mL）和GDNF（20 ng/mL）作用細胞48 h 后，能通過影響小鼠SSCs 的G0/G1和S、G2/M 期而影響細胞周期。隨著養(yǎng)精膠囊提取液濃度的升高，S 期細胞比例依次升高，高劑量養(yǎng)精膠囊組和GDNF 組與空白對照組相比， 分別是升高22.7%和34.5%， 有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明養(yǎng)精膠囊提取液和GDNF 能提高小鼠SSCs 的合成。

圖1 養(yǎng)精膠囊對SSCs 增殖活性、細胞周期的影響

二、養(yǎng)精膠囊促進cyclin D1 的表達

Cyclin D 有Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3 三個亞型，qRT-PCR 實驗表明（圖2A）， 養(yǎng)精膠囊（1 mg/mL）和GDNF（20 ng/mL）可以提高Cyclin D1 的轉(zhuǎn)錄水平，增加Cyclin D1 mRNA 的表達（P＜0.01），而對Cyclin D2、Cyclin D3 的轉(zhuǎn)錄水平無影響（P＞0.05）。 圖2B-2D 表明養(yǎng)精膠囊和GDNF 可以增加Cyclin D1 蛋白的表達， 而對Cyclin D2、Cyclin D3 蛋白的表達無明顯提高。

圖2 養(yǎng)精膠囊對Cyclin D mRNA 和蛋白水平的影響

三、養(yǎng)精膠囊通過cyclinD1 促進SSCs 增殖

圖3A 表明加入siRNA-Cyclin D1 預處理后再加入養(yǎng)精膠囊（1mg/mL）培養(yǎng)48 h，細胞的增殖活性與養(yǎng)精膠囊（1mg/mL）+siRNA-NC 組相比降低17.4%，有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），表明siRNA-Cyclin D1 能夠抑制小鼠SSCs 的增殖。 圖3B 表明養(yǎng)精膠囊+siRNA-Cyclin D1組與養(yǎng)精膠囊+siRNA-NC 組相比S 期細胞比例減少21.3%，有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。 圖3C、3D 表明養(yǎng)精膠囊+siRNA-Cyclin D1 組與養(yǎng)精膠囊+siRNA-NC 組相比Cyclin D1 mRNA 和蛋白的表達水平均降低。

四、養(yǎng)精膠囊通過PI3K-Akt 促進SSCs 增殖

圖3 阻斷Cyclin D1 后養(yǎng)精膠囊對SSCs 的影響

接下來采用PI3K 阻斷劑LY294002 阻斷PI3KAkt 通路，圖4A 表明加入LY294002 預處理后再加入養(yǎng)精膠囊（1 mg/mL）培養(yǎng)48 h，細胞的增殖活性與養(yǎng)精膠囊組（1 mg/mL）相比降低9.9%，有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），表明養(yǎng)精膠囊通過PI3K-Akt 通路促進SSCs 的增殖。 圖4B 表明養(yǎng)精膠囊+LY294002 組與養(yǎng)精膠囊組相比S期細胞比例減少12.1%， 有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。 圖4C、4D 表明，養(yǎng)精膠囊+LY294002 組與養(yǎng)精膠囊組相比Cyclin D1 mRNA 和蛋白的表達水平均降低。

圖4 阻斷PI3K-Akt 后養(yǎng)精膠囊對SSCs 的影響

討 論

養(yǎng)精膠囊是東南大學附屬中大醫(yī)院金保方教授運用中醫(yī)學“腎藏精”的理論，以補腎填精、益氣活血為治法創(chuàng)立的經(jīng)驗方，由淫羊藿、熟地、黃精、紫河車、沙苑子、煅牡蠣、黃芪、當歸、荔枝核、王不留行、炙水蛭共11味中藥組成。 方中淫羊藿味辛甘性溫，走肝腎二經(jīng)，為補命門、益精氣之要藥，熟地味甘性微溫，亦歸肝腎二經(jīng)，有補血養(yǎng)陰、填精益髓之功，九蒸九曬熟地為補血之首劑，淫羊藿配熟地，陰陽互根互用，增強療效。 紫河車乃血肉有情之品，扶正固本，養(yǎng)血益精，黃芪-黃精為補氣養(yǎng)陰固精的常用藥對，氣陰雙補，使得陽有所依。沙苑子、煅牡蠣其性下行，補腎固精，煅牡蠣還含有精子生長所必須的鋅、硒等微量元素。 荔枝核、當歸、炙水蛭、王不留行共奏行氣活血之功，使得藥物補而不滯，滋而不膩。 方中除了傳統(tǒng)補腎填精之藥，還添加了行氣活血之藥， 既能補腎入精室， 又能行氣活血以養(yǎng)精生精。 這種補腎填精與行氣活血藥物的配合，可改善睪丸和附屬性腺的內(nèi)環(huán)境，促進精子發(fā)生，提高臨床療效。

前期實驗研究表明，養(yǎng)精膠囊可以通過多途徑、多靶點改善睪丸的生精功能，通過VEGFA/eNOS 通路作用于睪丸的微循環(huán)，改善血管內(nèi)皮功能，促進血管的修復和新生[9,10]；通過Nur77/StAR 通路作用于睪丸間質(zhì)細胞，促進睪酮的合成，改善SSCs 生長的微環(huán)境，間接促進精子發(fā)生[11-13]；還可以直接作用于SSCs，與GDNF 受體GFRα1 結(jié)合，通過PI3K-Akt 通路，促進SSCs 的增殖[7]，但PI3K-Akt 通路下游的機制不清，還需進一步探索。 而Cyclin D 是PI3K-Akt 通路下游重要的調(diào)節(jié)蛋白，在SSCs 周期的調(diào)控中扮演著重要的角色，Cyclin D作為細胞周期的啟動因子，作用于G1 期，促進G1/S 期的過渡，進而促進SSCs 的增殖[14]。 本研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)精膠囊可以促進SSCs 的增殖、提高S 期細胞的比例（圖1），并且提高Cyclin D1 mRNA 和蛋白水平的表達， 但對Cyclin D2、Cyclin D3 的表達無影響（圖2）。 接下來運用siRNA-Cyclin D1 阻斷Cyclin D1 的表達，發(fā)現(xiàn)阻斷Cyclin D1 之后，SSCs 的增殖活性降低、S 期細胞比例減少，同時伴隨著Cyclin D1 的表達降低（圖3）。 最后， 運用PI3K 阻斷劑LY294002 進行阻斷PI3K-Ak 通路，發(fā)現(xiàn)阻斷之后同樣出現(xiàn)SSCs 的增殖活性降低、S 期細胞比例減少、以及p-Akt/Akt 和Cyclin D1 的表達降低（圖4）。

綜上， 補腎填精中藥養(yǎng)精膠囊可以通過PI3K-Akt通路作用于Cyclin D1，進而促進SSCs 增殖。 這對于闡明補腎填精法改善男性生殖功能的作用靶點，揭示“腎藏精”的科學內(nèi)涵，進而指導臨床運用中藥治療少弱精癥導致的男性不育， 提高男性的生殖健康和生活質(zhì)量均具有重要的理論意義和臨床價值。