方洪楓 趙光輝 吳漢瓊 鄭英姿 林 原 陳 劍 陳躬國(guó)

平菇胞外酶研究進(jìn)展綜述

方洪楓 趙光輝 吳漢瓊 鄭英姿 林 原 陳 劍 陳躬國(guó)

（福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福州 350018）

介紹平菇胞外酶的兩種常用研究方法：鑒別平板檢測(cè)法和分光光度法。從纖維素酶系和木質(zhì)素酶系兩大種類概述平菇胞外酶研究的最新進(jìn)展及主要成果，對(duì)平菇胞外酶的進(jìn)一步深入研究提出構(gòu)想。

平菇；胞外酶；平板檢測(cè)；分光光度；纖維素酶；漆酶

酶由活細(xì)胞產(chǎn)生，是對(duì)相應(yīng)底物具有特異性催化作用的蛋白質(zhì)或RNA。胞外酶是指在細(xì)胞外起作用的酶。平菇是有一定栽培規(guī)模的可食用大型真菌，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中菌絲能夠分泌大量胞外酶。平菇的胞外酶將培養(yǎng)料中大分子的纖維素和蛋白質(zhì)分別分解成小分子的單糖和氨基酸，提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)幫助菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體發(fā)育。國(guó)內(nèi)以平菇菌種選育和栽培技術(shù)等方面的研究為主，對(duì)胞外酶的研究報(bào)道并不多。根據(jù)目前已發(fā)表的文獻(xiàn)，對(duì)平菇胞外酶的研究多集中于水解酶類，如漆酶、羧甲基纖維素酶、淀粉酶和多酚氧化酶。本文綜述平菇胞外酶活性的兩種研究方法和對(duì)兩類胞外酶的最新研究進(jìn)展，為進(jìn)一步研究平菇胞外酶提供理論參考。

1 研究方法

1.1 鑒別平板檢測(cè)法

鑒別平板檢測(cè)法是快速篩選菌株的方法，包括平板透明圈法和平板變色圈法。平板透明圈法是在固體培養(yǎng)基中摻入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，待測(cè)菌株產(chǎn)生特定胞外酶分解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在菌落周圍形成透明圈。平板變色圈法是指在固體培養(yǎng)基中摻入指示劑，絕大多數(shù)胞外酶能夠與某些特定的物質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生顯色反應(yīng)[1]。透明圈和變色圈的大小能夠反映菌株利用和分解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或指示劑等特定物質(zhì)的能力，根據(jù)圈的大小，可初步判斷菌株產(chǎn)胞外酶的能力高低。

龔娜等以不同含量的純玉米芯為唯一碳源，采用剛果紅平板變色圈法快速篩選出產(chǎn)胞外纖維素酶的平菇菌株，能很好解決過(guò)去栽培周期長(zhǎng)、空間大等條件限制的問(wèn)題[2]。韋錦范采用愈創(chuàng)木酚、單寧酸和ABTS為底物的培養(yǎng)基初步篩選平菇產(chǎn)漆酶能力，根據(jù)透明圈/菌絲圈大小和變色特征，獲得8個(gè)漆酶活力較高的菌株[3]。高鋒等通過(guò)平板變色圈試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選用的平菇菌株能分泌羧甲基纖維素鈉酶、淀粉酶、漆酶、錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶等5種胞外酶[4]。應(yīng)立立等通過(guò)平板變色圈法篩選平菇木質(zhì)素降解菌株，結(jié)果以紅平菇降解木質(zhì)素的能力最強(qiáng)[5]。宋安東等對(duì)不同平菇菌株在PDA-Bavendamm平板和PDA-RB亮藍(lán)平板上進(jìn)行顯色試驗(yàn)，根據(jù)菌株在PDA-Bavendamm平板上形成的棕褐色輪環(huán)和在PDA-RB亮藍(lán)平板上形成的橙黃色變色圈，檢測(cè)出33個(gè)菌株能產(chǎn)漆酶，所有平菇菌株均可產(chǎn)生過(guò)氧化物酶[6]。

鑒別平板檢測(cè)法是從大量食用菌菌株中篩選產(chǎn)目標(biāo)胞外酶菌株的常用方法，是找到目標(biāo)菌株及判斷其能否產(chǎn)酶的關(guān)鍵基礎(chǔ)步驟，可以簡(jiǎn)單快速地辨別出該菌株是否產(chǎn)酶，為平菇等多種食用菌的產(chǎn)酶菌株篩選減少了大量的工作量和不必要的人力、物力消耗。同時(shí)通過(guò)透明圈或變色圈的直徑大小與菌落直徑大小的比值，可初步評(píng)價(jià)菌株的產(chǎn)酶能力，為后續(xù)定量測(cè)定酶活力大小提供參考。

1.2 分光光度法

分光光度法是通過(guò)測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)內(nèi)的吸光度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。這是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的方法之一，常見(jiàn)如用ABTS法測(cè)漆酶，DNS法測(cè)還原糖。

胡素娟等采用DNS法測(cè)定羧甲基纖維素酶活性，采用ABTS法測(cè)定漆酶活性，采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定中性蛋白酶活性，對(duì)比玉米芯、棉籽殼基質(zhì)發(fā)酵料栽培平菇不同生長(zhǎng)階段平菇胞外羧甲基纖維素酶（CMC）、木聚糖酶、中性蛋白酶和漆酶的活性[7]。周孟清等用分光光度法等對(duì)粗酶液的酶活性質(zhì)研究結(jié)果，平菇可產(chǎn)錳過(guò)氧化物酶（MnP）和漆酶（Lac）[8]。Sathishkumar和Palvanan取平菇液體培養(yǎng)對(duì)數(shù)期發(fā)酵液測(cè)漆酶活性，以ABTS作為反應(yīng)底物，濃度1 mmol/L，100 mmol/L反應(yīng)緩沖體系為醋酸溶液反應(yīng)體系，pH 5.5，反應(yīng)溫度為30 ℃，在420 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度[9]。最近，也有研究者采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定側(cè)耳屬的漆酶活性[10]。

分光光度法是實(shí)驗(yàn)室定量檢測(cè)平菇菌株中胞外酶的方法，長(zhǎng)時(shí)間的大量其他實(shí)驗(yàn)已證明該方法的精確性、可重復(fù)性，及其所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的快速、安全、可靠，克服了平板檢測(cè)法中菌株易受培養(yǎng)基厚度和pH值、指示劑的影響，以及受觀察時(shí)間、培養(yǎng)溫度等客觀因素的干擾等問(wèn)題，能夠進(jìn)一步驗(yàn)證和支持鑒別平板法的檢測(cè)結(jié)果。

2 胞外酶種類

2.1 纖維素酶系

纖維素酶可以將大分子纖維素分解成寡糖或單糖的蛋白質(zhì)，在分解纖維素時(shí)起生物催化作用。平菇栽培主要以含有大量纖維素的棉籽殼、木屑、棉稈等為原料，胞外纖維素酶可將纖維素分解成小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供菌絲體吸收、利用和子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育。羧甲基纖維素酶、濾紙酶皆屬于纖維素酶系。

溫海祥等通過(guò)比較平菇不同品種間羧甲基纖維素酶的酶活大小，發(fā)現(xiàn)品種間纖維素酶活力存在顯著差異[11]。孫江慧等研究發(fā)現(xiàn)平菇‘韓黑’分泌的纖維素酶活力較高，纖維素降解率高達(dá)45.84%，是產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)勢(shì)菌株[12]。馮光志等研究發(fā)現(xiàn)，Zn2+能促進(jìn)平菇胞外羧甲基纖維素酶的產(chǎn)生，在菌絲生長(zhǎng)期胞外羧甲基纖維素酶活性較弱，之后逐漸升高，在子實(shí)體成熟期，達(dá)到峰值，為19.87 U/g，子實(shí)體采摘后酶活隨之下降[13]。洪培等研究表明，Zn2+和Mn2+有效提高了纖維素酶活性，而Fe2+和Cu2+則抑制產(chǎn)酶活力[14]。傅真杰等發(fā)現(xiàn)適量 Mn2+和 Mg2+能促進(jìn)平菇菌絲發(fā)育和子實(shí)體形成，其中Mg2+能較大程度提升平菇纖維素酶活力，0.125 g/L Mg2+可使平菇纖維素酶活提升45. 05%[15]。

纖維素酶是平菇胞外酶研究中最常見(jiàn)的一類，目前研究主要集中在比較不同平菇品種間纖維素酶的活力和如何提高平菇纖維素酶活力。研究纖維素酶對(duì)平菇生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義，如篩選高產(chǎn)平菇菌株，生產(chǎn)過(guò)程中添加微量元素提高產(chǎn)量等。

2.2 木質(zhì)素酶系

漆酶和多酚氧化酶都是降解木質(zhì)素的重要催化劑，屬于木質(zhì)素酶系。它們將木質(zhì)素芳香族高分子化合物分解為小分子物質(zhì)供菌絲生長(zhǎng)。胞外漆酶和多酚氧化酶活性越強(qiáng)，菌株降解木質(zhì)素的能力就越強(qiáng)。

孫江慧等通過(guò)試驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)平菇8號(hào)降解木質(zhì)素的能力較強(qiáng)，木質(zhì)素降解率可達(dá)49.46%[12]。吳楠等研究的結(jié)果，紅平菇在大豆秸稈基質(zhì)中產(chǎn)漆酶活性最強(qiáng)，菌絲生長(zhǎng)旺盛，推測(cè)大豆秸稈中木質(zhì)素含量較高，有利于促進(jìn)平菇產(chǎn)漆酶[16]。玄家潔對(duì)平菇雙抗、860、89等3個(gè)品種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，比較菌絲長(zhǎng)勢(shì)和漆酶活力，發(fā)現(xiàn)菌絲的生長(zhǎng)勢(shì)與漆酶活力大小具有相關(guān)性[17]。周佳君等研究發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶與平菇的褐變有關(guān)，因此提出在平菇的生產(chǎn)儲(chǔ)存與運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)避免促進(jìn)多酚氧化酶產(chǎn)生的因素，以降低平菇的耗損[18]。楊清香等通過(guò)在玉米粉液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)2個(gè)平菇菌株能夠在液體發(fā)酵液中分泌高活性的漆酶，其中平菇831在液體中產(chǎn)酶活性于第10天達(dá)到最大值，為18 053.3 U/L[19]。申進(jìn)文等對(duì)平菇漆酶的研究證實(shí)，平菇在菌絲生長(zhǎng)階段的漆酶活性最高，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)在第一、二潮菇的間期，漆酶活性出現(xiàn)次高峰[20]。陳建軍等通過(guò)測(cè)定平菇在種子袋內(nèi)和出菇后不同生長(zhǎng)階段的漆酶酶活，發(fā)現(xiàn)平菇831在菌絲生長(zhǎng)時(shí)期漆酶的分泌量最高，最大值為151.6 U/g，而出菇后的漆酶酶活幾乎降為0。說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)需要漆酶參與，而子實(shí)體的發(fā)育則不再需要漆酶的參與[21]。

3 深入研究構(gòu)想

我國(guó)的平菇種類多、產(chǎn)量高，具有明顯的種質(zhì)資源優(yōu)勢(shì)，開展平菇胞外酶的研究，對(duì)于提高平菇產(chǎn)量和合理開發(fā)利用種質(zhì)資源具有重要意義。在有關(guān)平菇胞外酶的研究中，對(duì)漆酶的研究較為深入，也取得了一定的成果，但仍有很大的研究空間。目前大多數(shù)試驗(yàn)仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，并未將試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用于實(shí)際生產(chǎn)中。對(duì)于平菇漆酶的合成、作用機(jī)理和規(guī)律，酶的分離、純化及應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)等，都有待于進(jìn)一步的深入研究。關(guān)于平菇胞外酶活性的測(cè)定，可以探尋更多的方法，通過(guò)比較不同研究方法之間的準(zhǔn)確性，優(yōu)選出最適合的一種。隨著分子技術(shù)和基因工程的不斷進(jìn)步發(fā)展，將會(huì)有更多平菇的纖維素酶系和木質(zhì)素酶系的編碼基因被分離出來(lái)，可為平菇轉(zhuǎn)基因研究提供豐富的目的基因源，進(jìn)一步促進(jìn)平菇的研究。

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福建省福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017-N-46），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（CARS24）

方洪楓（1991—），女，碩士研究生，研究實(shí)習(xí)員，研究方向?yàn)槲⑸锷砩?E-mail：515512489@qq.com。

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