安朋朋，孫健，韓先干，劉光磊，劉禎，孫詠梅，馬玉蕾

（1.上海奶牛育種中心有限公司，上海 200436；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島 266109；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海市獸醫(yī)研究所，上海 200241 ）

奶牛乳房炎是造成奶牛養(yǎng)殖中經(jīng)濟(jì)損失的重要因素，及時發(fā)現(xiàn)感染牛只并進(jìn)行治療是降低乳房炎帶來的經(jīng)濟(jì)損失的關(guān)鍵。IDF推薦使用體細(xì)胞檢測和細(xì)菌學(xué)檢測作為判定奶牛乳房炎的方法。隨著DHI技術(shù)在國內(nèi)牧場的逐漸普及，體細(xì)胞數(shù)的快速檢測在奶牛乳房炎診斷，特別是隱性乳房炎診斷中發(fā)揮了重要作用。另外，牧場經(jīng)常使用CMT檢測進(jìn)行隱性乳房炎的現(xiàn)場篩查。然而，Pilla等[1]研究顯示，細(xì)菌感染在引起體細(xì)胞數(shù)顯著變化之前，不同的體細(xì)胞類型占比會出現(xiàn)明顯變化。Rivas等[2]通過向乳腺組織中人工接種金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞（PMN）及巨噬細(xì)胞比例在細(xì)菌感染過程中存在不同的變化規(guī)律，且流式細(xì)胞計數(shù)法相對于傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢測方法的敏感性和特異性更強(qiáng)。研究顯示[3,4]，健康乳腺組織中的體細(xì)胞主要由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞組成。而在感染乳區(qū)中可以檢測到高比例的PMN[5]。通常巨噬細(xì)胞增多可作為慢性炎癥、非化膿性炎癥的指標(biāo)；淋巴細(xì)胞增多作為慢性炎癥、病毒性感染的指標(biāo)；而PMN增多則為急性炎癥及炎癥早期的指標(biāo)。丹麥FOSS公司將其快速體細(xì)胞檢測設(shè)備進(jìn)行升級，實(shí)現(xiàn)了對乳中DSCC指數(shù)（淋巴細(xì)胞與PMN總數(shù)占體細(xì)胞數(shù)的比例）的連續(xù)檢測。上述研究為早期診斷乳房感染提供了一個新的方法，不同類型的體細(xì)胞在乳房早期感染中或許存在一些規(guī)律性變化。然而，對于不同類型的體細(xì)胞的變化規(guī)律研究并不多。

本研究通過對華東地區(qū)奶牛場進(jìn)行大量的牛奶樣品采集和檢測，研究DSCC在不同月份、胎次、泌乳天數(shù)等的變化規(guī)律，DSCC與體細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性，以及細(xì)菌感染對DSCC變化的影響，為DSCC在奶牛乳房炎早期診斷中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與樣品采集

2019年每月對華東地區(qū)18個奶牛場進(jìn)行DHI奶樣采集。采樣前對乳頭進(jìn)行前藥浴并棄掉頭三把奶，使用分流式采樣杯進(jìn)行全過程采樣，分流獲得的奶樣進(jìn)行充分搖勻后，取40mL倒入放有防腐劑的樣品瓶中，震蕩使防腐劑充分溶解。將樣品置于陰涼通風(fēng)處，并于3日內(nèi)送到上海DHI檢測中心。

2020年選擇上海地區(qū)某奶牛場，開展連續(xù)5d的全群牛奶樣品采集，每頭奶牛使用無菌采樣瓶采集兩份，其中一份-20℃冷凍保存，其他采樣要求同上。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 主要儀器

FOSS CombiFossTM 7 DC乳成分和體細(xì)胞聯(lián)機(jī)分析儀、Agilent Technologies Stratagene Mx3005P PCR儀、Thermo Multifuge X3 離心機(jī)、SW-CJ-2D 超凈工作臺、恒溫水浴鍋、冷庫、冰箱。

1.2.2 主要試劑

FOSS染色液、布羅波爾防腐劑、易瑞牛奶微生物DNA提取試劑盒、易瑞牛乳房炎病原菌核酸檢測試劑盒。

1.3 測定指標(biāo)與測定方法

1.3.1 測定指標(biāo)

體細(xì)胞數(shù)（SCC）、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、尿素氮、體細(xì)胞分型指數(shù)（DSCC）、乳房炎致病菌（酵母菌、化膿隱秘桿菌、大腸桿菌、葡萄球菌屬、牛棒狀桿菌、支原體屬、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、原壁菌屬、粘質(zhì)沙雷氏菌、停乳鏈球菌、腸球菌屬、牛支原體、乳房鏈球菌、克雷伯氏菌屬）。

1.3.2 測定方法

將牛奶樣品置于42℃恒溫水浴鍋中，水浴15min，使用FOSS CombiFossTM 7 DC乳成分和體細(xì)胞聯(lián)機(jī)分析儀測定牛奶中乳成分、體細(xì)胞數(shù)（SCC）和體細(xì)胞分型指數(shù)（DSCC）。

用于乳房炎致病菌檢測的牛奶樣品從-20℃冰箱中取出，常溫解凍，使用易瑞牛奶微生物DNA提取試劑盒和牛乳房炎病原菌核酸檢測試劑盒用Agilent Technologies Stratagene Mx3005P PCR儀進(jìn)行乳房炎致病菌檢測，檢測流程參考易瑞試劑盒使用說明。

1.4 統(tǒng)計方法

使用office 2010和PASW Statistics 18對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析。

2 結(jié)果

2.1 SCS（體細(xì)胞評分）與DSCC相關(guān)性研究

對2019年DSCC檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，剔除乳脂率低于3.0%且高于6.5%的數(shù)據(jù)，以及SCS、DSCC為0的數(shù)據(jù)，共獲得37 096條有效數(shù)據(jù)。

表1顯示了SCS與DSCC的相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，SCS平均值為3.92，標(biāo)準(zhǔn)差為1.56，DSCC的平均值為69.51，標(biāo)準(zhǔn)差為14.58，二者存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.549（P=0.000）。

圖1 SCS與DSCC的坐標(biāo)系散點(diǎn)分布

圖1為SCS與DSCC的坐標(biāo)系散點(diǎn)分布圖。從圖中可以看出，隨著SCS的升高，DSCC的波動范圍逐漸減小，波動范圍最低值隨SCS的升高快速升高，而最高值呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。SCS＜2范圍內(nèi)散點(diǎn)分布極少，主要是因?yàn)槿コ薉SCC為0的數(shù)據(jù)。

圖2顯示了不同SCS區(qū)間對應(yīng)的DSCC平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。從圖中可以看出，隨著SCS的升高，DSCC平均值逐漸升高，標(biāo)準(zhǔn)差逐漸減小。

表1 SCS與DSCC相關(guān)性分析

圖2 DSCC隨SCS變化趨勢

2.2 不同月份間DSCC變化規(guī)律研究

2019年1～12月，每月選擇18個牧場，對DSCC的群體分布進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，DSCC在40%以下的個體牛占比不足5%，75%左右的個體牛DSCC值都在70%～90%之間，DSCC為90%以上的個體牛也不足5%。另外，月份之間DSCC的區(qū)間分布基本穩(wěn)定，未出現(xiàn)顯著的規(guī)律性變化。

圖3 DSCC群體區(qū)間分布

對不同月份間DSCC均值差異進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，各月份之間DSCC差異不顯著。從差值的絕對值看，各月份間DSCC非常接近，幾乎未表現(xiàn)出明顯的月份間變化規(guī)律。從DSCC各月均值圖看，除3月和12月DSCC分別為66.16%和66.80%外，其他各月均值都在68.56%～71.88%之間，差異不大。

表2 不同月份DSCC差異情況

2.3 胎次和泌乳階段對DSCC的影響的研究

選擇4個牧場5月份的數(shù)據(jù)，進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)整合，共獲得1 515條有效數(shù)據(jù)，研究了不同胎次和泌乳階段對DSCC的影響，結(jié)果見表3和表4。結(jié)果顯示，頭胎牛DSCC顯著高于二胎、三胎以及三胎以上的牛，三胎以上牛DSCC顯著高于三胎牛，其他差異不顯著。不同泌乳階段之間DSCC均無顯著差異。另外，胎次和泌乳階段之間交互效應(yīng)不顯著。

表3 不同胎次DSCC均值差異分析

表4 不同泌乳階段DSCC均值分析

2.4 不同乳房炎致病菌下DSCC差異研究

共對78個樣品進(jìn)行乳房炎致病菌檢測，其中55個樣品呈現(xiàn)致病菌陽性，陽性率70.51%。對陰性樣品和陽性樣品DSCC進(jìn)行比較，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，陰性樣品DSCC極顯著低于陽性樣品，P值為0.002。

表5 細(xì)菌感染對DSCC的影響

共檢出14種主要致病菌，將致病菌分為傳染性致病菌和環(huán)境性致病菌兩種類型。傳染性致病菌包括：葡萄球菌屬、牛棒狀桿菌、支原體屬、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、牛支原體；環(huán)境性致病菌包括：酵母菌、化膿隱秘桿菌、大腸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、腸球菌屬、乳房鏈球菌屬、克雷伯氏菌屬。結(jié)果，檢出傳染性致病菌樣品7個，占比12.73%，檢出環(huán)境性致病菌樣品28個，占比50.91%，檢出兩類致病菌的混合感染樣品20個，占比36.36%（表6）。分析結(jié)果顯示，傳染性致病菌組、環(huán)境性致病菌組及混合感染組DSCC均值均高于未感染組，其中環(huán)境性致病菌組DSCC極顯著高于未感染組（P=0.000），但與傳染性致病菌組和混合感染組差異不顯著，傳染性致病菌組和混合感染組之間及該兩組與未感染組之間均差異不顯著。結(jié)合PMN的炎癥指示意義，可推測這些奶牛或處于乳房炎感染早期。

表6 不同細(xì)菌感染類型間DSCC差異研究

3 討論

3.1 SCS與DSCC的相關(guān)性

研究結(jié)果表明，SCS與DSCC存在一定的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)中等（R2=0.549），這與劉建營[6]等的研究結(jié)果基本一致。汪悅等[7]的研究顯示，隨著SCC的增加，PMN存在上升的趨勢（R2=0.8773），淋巴細(xì)胞存在下降趨勢（R2=0.7431），而巨噬細(xì)胞相對穩(wěn)定。本研究采用的檢測方法無法區(qū)分PMN與淋巴細(xì)胞，但從SCS與DSCC的相關(guān)性分析結(jié)果看，采用DSCC指標(biāo)同樣可以在一定程度上體現(xiàn)與體細(xì)胞間的關(guān)系。另外，不同研究對于巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞隨體細(xì)胞數(shù)的變化規(guī)律仍存在較大爭議，大多公開的研究顯示，巨噬細(xì)胞在體細(xì)胞中的比例相對穩(wěn)定，而淋巴細(xì)胞與體細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而FOSS公司的研究則正好相反，巨噬細(xì)胞與體細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，而淋巴細(xì)胞比例相對穩(wěn)定。造成上述差異的原因極有可能是樣品采集方法和樣品前處理造成的。FOSS的研究采用了DHI奶樣，且檢測前未對奶樣進(jìn)行離心等前處理，完全使用原樣檢測，而其他絕大多數(shù)研究采用的是擠奶前的乳區(qū)采樣，且均進(jìn)行了復(fù)雜的前處理過程。Sarikaya等[8]的研究顯示，擠奶過程中體細(xì)胞組成會發(fā)生明顯變化，另外，有研究顯示，巨噬細(xì)胞在體細(xì)胞提取過程中會因其較強(qiáng)的附著性而造成損失。上述爭議仍需要進(jìn)行深入的研究。

另外，從SCS與DSCC的散點(diǎn)分布特點(diǎn)說明，隨著SCS的升高，DSCC的波動范圍逐漸縮小，在SCS低于3時（對應(yīng)SCC為10萬個/mL），DSCC在50%～75%之間的普遍存在，這或許意味著在體細(xì)胞數(shù)未達(dá)到目前公認(rèn)的健康乳腺標(biāo)準(zhǔn)（SCC＜10萬個/mL）時已經(jīng)存在感染。Schwarz等[3]及Pilla等[1]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SCC為1 000個/mL時仍可檢出存在細(xì)菌感染的樣品。汪悅等發(fā)現(xiàn)，SCC為7.6萬～10萬個/mL組的PMN比例顯著高于SCC低于7.6萬個/mL組，結(jié)合蛋白組學(xué)研究認(rèn)為，細(xì)菌感染的啟動應(yīng)在更低的體細(xì)胞數(shù)水平。上述研究與本研究結(jié)果表明，細(xì)菌感染在SCC低于現(xiàn)有健康乳腺標(biāo)準(zhǔn)時確實(shí)存在，然而，仍缺乏通過體細(xì)胞類型數(shù)據(jù)判定細(xì)菌感染的直接依據(jù)，需進(jìn)一步研究。

3.2 DSCC隨泌乳月份、泌乳天數(shù)、胎次的變化規(guī)律

研究結(jié)果顯示，不同月份之間DSCC相對穩(wěn)定，這與SCC存在的季節(jié)性變化完全不同。另外，不同群體間DSCC數(shù)值區(qū)間的分布存在非常相似的規(guī)律性變化。另外，DSCC的群體均值基本接近70%。上述群體分布特點(diǎn)為揭示DSCC與細(xì)菌感染的關(guān)系奠定了研究基礎(chǔ)。相關(guān)研究未見報端，主要因?yàn)榇蠓秶臄?shù)據(jù)收集僅能依靠DHI檢測平臺實(shí)現(xiàn)，而FOSS的新型檢測設(shè)備近幾年才開始應(yīng)用。

泌乳天數(shù)對DSCC的影響研究發(fā)現(xiàn)，泌乳天數(shù)的變化未造成DSCC的顯著性變化，這與SCS隨泌乳天數(shù)的變化規(guī)律不同[9]。而Dosogne等[10]的研究認(rèn)為泌乳早期的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比泌乳中后期高，而巨噬細(xì)胞和PMN的比例則低得多。造成差異的原因可能與試驗(yàn)設(shè)計不同有關(guān)，Dosogne等的研究僅選擇21頭泌乳牛作為試驗(yàn)對象，雖然可以排除環(huán)境、季節(jié)、飼養(yǎng)等因素的影響，但影響體細(xì)胞組成和乳房感染的因素很多，有限的數(shù)據(jù)使誤差對結(jié)果的影響過大。本試驗(yàn)使用群體數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，一定程度上降低了誤差對結(jié)果的影響程度，相對可靠性更高。

胎次對DSCC的影響研究發(fā)現(xiàn)，頭胎牛DSCC顯著高于二胎、三胎以及三胎以上的牛，猜測隨著年齡的變化，乳腺中主要的免疫機(jī)制存在差異。奶牛乳腺天然免疫防御機(jī)制存在多種通路，并且是同時存在相互協(xié)同作用的[11]，不同胎次的奶牛在抵抗細(xì)菌感染的過程中，是否存在不同的免疫機(jī)制，導(dǎo)致參與免疫的細(xì)胞類型存在差異，有待進(jìn)一步研究。

3.3 不同乳房炎致病菌對DSCC的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)菌檢測陽性率達(dá)到70.51%，這比孫健等研究的上海奶牛乳房炎致病菌檢出率低[12]，但仍處于很高的水平，或許說明群體中乳腺細(xì)菌感染是普遍存在的。細(xì)菌檢測陽性樣品的DSCC極顯著高于陰性樣品，這與汪悅等的研究結(jié)果一致[13]。而傳染性致病菌和環(huán)境性致病菌對DSCC影響的比較研究未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，這可能與數(shù)據(jù)量較小有關(guān)。有研究顯示，傳染性致病菌與環(huán)境性致病菌對乳蛋白組成的影響存在明顯差異，說明機(jī)體對于兩種致病菌的免疫機(jī)制存在區(qū)別，這或許會造成體細(xì)胞組成的不同。后續(xù)研究需增加檢測范圍，提高數(shù)據(jù)的可靠性。

4 結(jié)論

DSCC對于揭示乳房炎早期感染存在一定的研究價值，但體細(xì)胞組成與乳腺組織復(fù)雜的免疫機(jī)制相關(guān)，其應(yīng)用尚需進(jìn)一步研究。

DSCC不存在季節(jié)性變化規(guī)律，也不隨泌乳天數(shù)變化發(fā)生顯著變化，但不同胎次間DSCC存在差異。

乳房炎致病菌感染造成DSCC的顯著上升，不同致病菌類型對DSCC的影響尚需進(jìn)一步研究。