一株Thuidium cymbifolium內(nèi)生細(xì)菌的鑒定及其抑制真菌活性研究

謝 穎，劉祎煒，劉安巧，曲如夢(mèng)，雷夢(mèng)瑤，王新廣，張莉娜，羅先群

(海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院，海南 ?？?570228)

植物內(nèi)生菌是指在健康植物的組織或細(xì)胞間隙中生活的一類微生物，不會(huì)引起宿主產(chǎn)生明顯的病理癥狀，主要是真菌、細(xì)菌和放線菌[1]。植物內(nèi)生菌與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，植物給內(nèi)生菌提供營(yíng)養(yǎng)，內(nèi)生菌產(chǎn)生有生物活性的代謝產(chǎn)物，如抗生素類物質(zhì)、水解酶、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、生物堿等，通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性、促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)或增強(qiáng)抵抗力等幾種機(jī)制來(lái)防治植物病害[2]。趙媛等[3]從對(duì)葉紅景天中分離出的24 株菌中有12株菌對(duì)蠶豆莢枯萎病病原菌、菜豆黑斑病病原菌、茄鐮刀菌Ⅰ、茄鐮刀菌Ⅱ有不同程度的抑制作用，抑菌圈直徑均在5 mm以上。柳志強(qiáng)等[4]發(fā)現(xiàn)催吐蘿芙木內(nèi)生菌BacillussubtilisLYM3對(duì)10種植物病原真菌均有較強(qiáng)的拮抗作用，抑菌率均在60%以上，其中對(duì)香蕉炭疽病病原菌的抑菌率達(dá)到83.5%。以上研究均說(shuō)明植物內(nèi)生菌在農(nóng)作物病害防治方面有巨大的應(yīng)用潛力。

苔蘚植物是高等植物中構(gòu)造最簡(jiǎn)單的一類植物，全世界約有苔蘚植物24 000種，種類僅次于種子植物，且分布十分廣泛[5-6]。苔蘚內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物具有顯著的細(xì)胞毒性，能夠抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[7-9]。

白絹病、香蕉枯萎病及芒果炭疽病等植物真菌病害嚴(yán)重影響作物和果蔬的生長(zhǎng)。通過(guò)內(nèi)生菌或其產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物來(lái)對(duì)植物病害進(jìn)行生物防治，能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)、避免化學(xué)殺菌劑污染，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中日益受到重視[2]。龔國(guó)利等[10]對(duì)植物內(nèi)生芽孢桿菌在微生物農(nóng)藥、抗菌、抗腫瘤、生物法修復(fù)環(huán)境等方面的應(yīng)用研究進(jìn)行了綜述。目前，對(duì)蘚類內(nèi)生菌防治植物真菌病害的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，作者首次對(duì)海南大羽蘚(Thuidiumcymbifolium)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離、純化和分子鑒定，通過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵液抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)定其對(duì)常見(jiàn)植物病原菌的抑制效果，以豐富藥用植物內(nèi)生細(xì)菌的生防資源，為發(fā)掘新型內(nèi)生細(xì)菌活性代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 苔蘚樣品與受試真菌

大羽蘚(Thuidiumcymbifolium)，采自海拔1 330 m的海南省省級(jí)自然保護(hù)區(qū)鸚哥嶺(19°2′34″N，190°33′7″E)。大羽蘚樣品生存環(huán)境是腐爛樹(shù)木的根部，采集后儲(chǔ)存于海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院生物工程系實(shí)驗(yàn)室。

受試真菌為蔓枯病、稻瘟病、白絹病、香蕉枯萎病、立枯絲核病和芒果炭疽病等病原菌，由海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院生物科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL。

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。馬鈴薯切塊，煮沸30 min后，紗布過(guò)濾收集濾液。

1.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

將采集的新鮮大羽蘚樣品洗凈，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，浸泡于75%乙醇中表面消毒1～2 min后用無(wú)菌水沖洗4次，然后用5%NaClO溶液浸泡2～3 min，再用無(wú)菌水清洗4次[11]。用無(wú)菌水檢驗(yàn)法和組織痕跡法驗(yàn)證。將表面消毒合格的大羽蘚葉片充分研磨，加入200 μL無(wú)菌水稀釋，涂布于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)數(shù)天后，得到不同形態(tài)的菌落。將不同形態(tài)的菌落分別進(jìn)行梯度稀釋，選取合適的稀釋梯度，取100 μL稀釋液涂布于平板上，37 ℃培養(yǎng)1 d，得到多個(gè)單菌落。多次重復(fù)分離純化步驟，直到培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落均為同一種菌為止。將純化后的菌株轉(zhuǎn)移至試管斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)6～8 d，然后放入4 ℃冰箱中保存，備用。

1.4 生長(zhǎng)曲線的繪制

將保存于試管斜面的內(nèi)生細(xì)菌TC01接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 d，得到活化種液。取30支潔凈的試管，各加100 μL種液及5 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)；測(cè)定培養(yǎng)液在560 nm處的OD560值，每次取3支不同試管的培養(yǎng)液進(jìn)行測(cè)定并取平均值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5 內(nèi)生細(xì)菌TC01的分子生物學(xué)鑒定

內(nèi)生細(xì)菌TC01進(jìn)行純培養(yǎng)得到單菌落，送賽默飛世爾儀器有限公司廣州分公司進(jìn)行測(cè)序。擴(kuò)增引物為：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。將內(nèi)生細(xì)菌TC01的16S rDNA序列在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇并下載同源性最高的幾條序列。使用ClustalW對(duì)搜集的序列進(jìn)行多序列比對(duì)[12]，根據(jù)比對(duì)結(jié)果使用MEGA X軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap分析中使用1 000次重復(fù)計(jì)算NJ樹(shù)的支持率。

1.6 內(nèi)生細(xì)菌TC01與受試真菌的平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)

PDA培養(yǎng)基高溫滅菌，超凈工作臺(tái)紫外消毒30 min。在超凈工作臺(tái)內(nèi)倒平板，用無(wú)菌打孔器在PDA平板中心打取直徑約6 mm的餅，將受試真菌菌餅接入其中，挑取內(nèi)生細(xì)菌TC01在距離中心約2 cm處兩邊劃兩條平行菌線，以僅接入受試真菌的平板作為空白對(duì)照。28 ℃培養(yǎng)2～4 d，觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組真菌的生長(zhǎng)狀況，用游標(biāo)卡尺測(cè)量真菌菌落直徑，并按下式計(jì)算抑菌率：

式中：D為對(duì)照組受試真菌菌落直徑；d為實(shí)驗(yàn)組受試真菌菌落直徑。

1.7 內(nèi)生細(xì)菌TC01發(fā)酵液抑菌實(shí)驗(yàn)

將保存于試管斜面的內(nèi)生細(xì)菌TC01接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)5 d；將發(fā)酵液于4 000 r·min-1離心10 min，取上清液。將一部分發(fā)酵液和PDA培養(yǎng)基按3∶7的比例進(jìn)行混合后高溫滅菌倒平板；一部分發(fā)酵液用濾膜除菌，與已滅菌的PDA培養(yǎng)基按3∶7的比例混合后倒平板，研究發(fā)酵液除菌方式對(duì)抑菌效果的影響。用打孔器將受試真菌的菌餅接入平板中央，每組設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，以未混有內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的培養(yǎng)基接入真菌菌餅作為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)，觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組真菌的生長(zhǎng)狀況，每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量真菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。使用SPSS 17.0進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)生細(xì)菌TC01的菌落形態(tài)

從海南大羽蘚葉片中分離純化得到了內(nèi)生細(xì)菌TC01，其菌落形態(tài)在培養(yǎng)前期為白色不透明，形狀呈圓形凸起，邊緣整齊，表面光滑有光澤；在培養(yǎng)后期邊緣向四周發(fā)散，形狀呈不規(guī)則棒狀。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌TC01的生長(zhǎng)曲線

以O(shè)D560值為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制內(nèi)生細(xì)菌TC01的生長(zhǎng)曲線，如圖1所示。

圖1 內(nèi)生細(xì)菌TC01的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of endophytic bacterium TC01

由圖1可知，1～2 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，內(nèi)生細(xì)菌TC01快速生長(zhǎng)；2～6 d為穩(wěn)定期，內(nèi)生細(xì)菌TC01的生長(zhǎng)趨緩；6 d后，內(nèi)生細(xì)菌TC01的生長(zhǎng)曲線緩慢下降。與普通細(xì)菌相比，內(nèi)生細(xì)菌TC01的生長(zhǎng)周期明顯更長(zhǎng)。

2.3 內(nèi)生細(xì)菌TC01的分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)內(nèi)生細(xì)菌TC01的16S rDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 內(nèi)生細(xì)菌TC01的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of endophytic bacterium TC01

由圖2可知，內(nèi)生細(xì)菌TC01與Viridibacillus(綠芽孢桿菌)在同一個(gè)分支，同源性最高為99.86%，結(jié)合菌落特征，可判斷內(nèi)生細(xì)菌TC01為綠芽孢桿菌。

2.4 內(nèi)生細(xì)菌TC01與受試真菌的平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)

內(nèi)生細(xì)菌TC01與白絹病病原菌的平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3a所示，內(nèi)生細(xì)菌TC01對(duì)4種受試真菌的最大抑菌率如圖4所示。

由圖4可知，內(nèi)生細(xì)菌TC01對(duì)4種受試真菌均表現(xiàn)出了較明顯的抑制作用(最大抑菌率均在50%以上)，其中對(duì)芒果炭疽病病原菌的抑制作用最明顯，最大抑菌率可達(dá)83.0%。

圖3 平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)(a)及發(fā)酵液抑菌實(shí)驗(yàn)(b)Fig.3 Plate confrontation experiment(a) and fermentation broth antifungal experiment(b)

注：不同字母之間表示差異顯著(P<0.05)

2.5 內(nèi)生細(xì)菌TC01發(fā)酵液抑菌實(shí)驗(yàn)

內(nèi)生細(xì)菌TC01發(fā)酵液對(duì)白絹病病原菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3b所示。不同除菌方式下，內(nèi)生細(xì)菌TC01發(fā)酵液對(duì)6種受試真菌的最大抑菌率如圖5所示。

注：不同字母之間表示差異顯著(P<0.05)

由圖5可知，(1)在抑菌效果方面，內(nèi)生細(xì)菌TC01發(fā)酵液對(duì)白絹病病原菌、立枯絲核病病原菌的抑制作用非常顯著。在高溫滅菌和過(guò)濾除菌方式下，內(nèi)生細(xì)菌TC01發(fā)酵液對(duì)白絹病病原菌的最大抑菌率分別達(dá)到88.7%和92.8%，對(duì)立枯絲核病病原菌的最大抑菌率分別達(dá)到92.6%和91.9%；(2)在發(fā)酵液除菌方式方面，通過(guò)高溫滅菌和過(guò)濾除菌處理的內(nèi)生細(xì)菌TC01發(fā)酵液對(duì)白絹病、香蕉枯萎病、立枯絲核病和芒果炭疽病等4種病原菌的最大抑菌率差別不大，而對(duì)蔓枯病病原菌、稻瘟病病原菌的最大抑菌率存在顯著性差異，其中過(guò)濾除菌的發(fā)酵液對(duì)蔓枯病病原菌的抑菌率比高溫滅菌的高約40%。究其原因，可能是由于內(nèi)生細(xì)菌TC01抑制蔓枯病病原菌的有效成分是不耐高溫的物質(zhì)，如多肽、水解酶等，或是在高溫下易揮發(fā)的物質(zhì)。程媛媛等[13]從華重樓內(nèi)生菌發(fā)酵液中分離出一種抗菌肽，由7種氨基酸組成，對(duì)玉米彎孢病病原菌等真菌和大腸桿菌等細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用；Maddau等[14]從橡木內(nèi)生菌的液體培養(yǎng)物中分離并鑒定了多肽抗生素的混合物，該混合物對(duì)7種重要的林木病原菌顯示出強(qiáng)大的抗真菌活性；Yuan等[15]從銀杏中分離出一株解淀粉芽孢桿菌，從其乙酸乙酯提取物中獲得了脂肽類抗真菌化合物，在體外對(duì)毛雙孢屬真菌和可可毛色二孢菌表現(xiàn)出強(qiáng)大的生長(zhǎng)抑制活性。但是內(nèi)生細(xì)菌TC01發(fā)酵液對(duì)稻瘟病病原菌的抑制情況卻不同，高溫滅菌的抑菌率比過(guò)濾除菌的抑菌率要高，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)(代謝物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定)確定原因所在。

2.6 抑菌機(jī)理探討

生物防治植物病害的主要機(jī)制包括分泌抗菌物質(zhì)、與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位、誘導(dǎo)植物抗性以及促進(jìn)植物生長(zhǎng)等[16]。平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中，所有受試真菌菌餅都沒(méi)能生長(zhǎng)越過(guò)內(nèi)生細(xì)菌TC01的細(xì)菌線(圖3a)，可以認(rèn)為其抑制真菌的機(jī)理可能是與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位。羅琳等[17]從紅棗中分離獲得的解淀粉芽孢桿菌T12主要依靠菌體本身與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和重寄生作用產(chǎn)生纖維素酶對(duì)葡萄灰霉菌發(fā)揮拮抗作用。

發(fā)酵液抑菌實(shí)驗(yàn)中，受試真菌雖然能生長(zhǎng)，但是較對(duì)照組來(lái)說(shuō)生長(zhǎng)非常緩慢，而且菌絲發(fā)育不良，可以認(rèn)為內(nèi)生細(xì)菌TC01可能產(chǎn)生有抑制真菌生長(zhǎng)的抗生素、水解酶類、生物堿等活性物質(zhì)或者抑制孢子萌發(fā)，造成病原菌菌絲畸形。劉先寶等[18]篩選獲得一株勞爾氏菌，其乙酸乙酯相提取物能夠抑制香蕉枯萎病病原菌菌絲果膠酶活性和蛋白質(zhì)的含量，并通過(guò)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生抑菌作用；布婷婷等[19]發(fā)現(xiàn)了一株枯草芽孢桿菌Y13對(duì)油茶炭疽病病原菌菌絲有抑制、致畸作用，還能抑制分生孢子的萌發(fā)。

3 結(jié)論

從海南大羽蘚葉片中分離純化得到一株內(nèi)生細(xì)菌TC01，不僅豐富了熱區(qū)苔蘚內(nèi)生細(xì)菌的資源，也為海南作物和水果病害的生物防治奠定了基礎(chǔ)。內(nèi)生細(xì)菌TC01具有較好的生防潛力，有深入研究和開(kāi)發(fā)的價(jià)值。