陳俊良 練長勛 葉曉星 吳國鋒 陶祥生

利用真空冷凍干燥法制作大型真菌標(biāo)本

陳俊良 練長勛 葉曉星 吳國鋒 陶祥生*

（慶元縣食用菌科研中心，浙江 慶元 323800）

介紹利用真空冷凍干燥技術(shù)制作大型真菌標(biāo)本具有較多優(yōu)點(diǎn)：可保持標(biāo)本外觀大小、形狀、顏色不變，蛋白質(zhì)等物質(zhì)不變性；制成后的標(biāo)本，科研價值高，可進(jìn)行孢子顯微觀察、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，有效成分測定等科學(xué)研究，保存在放有硅膠干燥劑的密封袋中，拿取方便；該法操作方便，適用于保存各種大小、顏色的大型真菌標(biāo)本。具體操作步驟為采集新鮮完整的大型真菌子實體標(biāo)本，除雜；使用－40°C冰箱預(yù)凍處理；利用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空冷凍干燥；將凍干標(biāo)本放置在密閉的亞克力標(biāo)本瓶、密封袋中保藏。

大型真菌標(biāo)本；真空冷凍干燥；亞克力標(biāo)本瓶；科研價值

大型真菌含水量高，容易腐爛、生蟲，在標(biāo)本處理、保藏上具有一定難度。傳統(tǒng)大型真菌標(biāo)本的制作方法主要采用浸漬法和干制法[1]。浸漬標(biāo)本一般保存在甲醛、乙醇、冰醋酸等易揮發(fā)保存液中，標(biāo)本易發(fā)硬變脆、褪色，不保鮮，保存液易渾濁，必須經(jīng)常更換[2]。干制標(biāo)本是采用日曬、烘干或風(fēng)干的方法進(jìn)行干燥處理，標(biāo)本易失水而嚴(yán)重變形，且易蟲蛀、回潮、霉變等[2]。

近年來，也新研發(fā)了一些大型真菌標(biāo)本的制作方法，專利《一種大型真菌標(biāo)本的制作方法》（CN107668028A）公開了一種向模具中灌注環(huán)氧樹脂型水晶滴膠包裹大型真菌子實體的標(biāo)本制作方法。專利《一種大型真菌標(biāo)本的制作方法》（CN105325404A）公開了一種將真空干燥后的標(biāo)本完全浸漬于環(huán)氧樹脂中，直至完全滲透，取出標(biāo)本瀝干保藏的大型真菌標(biāo)本制作方法。專利《一種大型真菌標(biāo)本的制作方法》（CN104996397A）公開了一種將大型真菌標(biāo)本用聚乙二醇塑化，塑化后的標(biāo)本用濾紙吸干其表面塑化劑，再用透明脲醛樹脂與塑化好的大型真菌標(biāo)本完全融合的方法。但這些方法使得大型真菌標(biāo)本包埋于環(huán)氧樹脂、透明脲醛樹脂等中，無法取出進(jìn)行顯微特征觀察、形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，在種名確定上具有很大難度。此類標(biāo)本僅適用于科普展示，不適用于科學(xué)研究。

真空冷凍干燥法是將含水物質(zhì)凍結(jié)成固態(tài)，然后在低溫、真空狀態(tài)下使其中的水從固態(tài)升華成氣態(tài)，最終除去水分而保存物質(zhì)的方法。筆者于2013年開始嘗試?yán)谜婵绽鋬龈稍锛夹g(shù)制作大型真菌標(biāo)本，干燥后存放在有硅膠干燥劑的密閉亞克力標(biāo)本瓶和密封袋中。此方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：一是保持標(biāo)本外觀大小、形狀、顏色不變；大型真菌的蛋白質(zhì)等物質(zhì)也不會變性。二是科研價值高，凍干后的標(biāo)本可保存在硅膠干燥劑的密封袋中，方便拿取，可進(jìn)行孢子顯微觀察、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定、有效成分測定等科學(xué)研究。三是操作方便，適用于保存各種大小、各種顏色的大型真菌標(biāo)本。四是采用透明度高的亞克力標(biāo)本保存，便于清晰地、全方位地觀察標(biāo)本。

本方法突破了傳統(tǒng)烘干標(biāo)本，因縮水變形嚴(yán)重、褪色而形態(tài)學(xué)鑒定困難等問題，也解決了新型包埋展示標(biāo)本，難以取出鑒定研究等難題，是一種既能適用于科普展示、教學(xué)，又適用于科學(xué)研究的大型真菌標(biāo)本制作方法，為大型真菌標(biāo)本制作開辟了新的路徑。目前，已經(jīng)制作真空冷凍干燥標(biāo)本200余份，其中130種陳列展示于浙江省麗水市博物館。

1 設(shè)備與材料

LGJ-50C冷凍干燥機(jī)，亞克力標(biāo)本瓶，密封袋，變色硅膠。

2 標(biāo)本制作步驟

標(biāo)本制作流程：大型真菌標(biāo)本采集→記錄建檔→標(biāo)本表面清理→預(yù)凍處理→設(shè)定凍干工藝程序→真空冷凍干燥→裝瓶密封。

2.1 標(biāo)本預(yù)處理

采集新鮮、完整的大型真菌子實體標(biāo)本，進(jìn)行初步整理，除去泥土和雜物，記錄形態(tài)學(xué)特征，填寫檔案卡；將標(biāo)本按照大小、厚薄進(jìn)行分類，置于－40 ℃冰箱預(yù)凍處理6～8小時。

2.2 冷凍干燥

將冷凍干燥機(jī)提前1小時啟動，至冷阱溫度達(dá)到－40 ℃時，將已預(yù)凍的標(biāo)本從冰箱移到冷阱托盤內(nèi)。設(shè)定冷凍干燥機(jī)凍干工藝程序，真空干燥16～20小時。

2.3 標(biāo)本保存

真空干燥結(jié)束后，將標(biāo)本從凍干機(jī)取出迅速放到干燥器皿中，避免回潮；在亞克力標(biāo)本瓶底部粘貼泡沫底座，將標(biāo)本固定在底座上，周邊放置變色硅膠，迅速密封。同時，留存一份凍干標(biāo)本放入裝有標(biāo)色硅膠的密封袋中，用于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。

3 真空冷凍干燥

3.1 冷阱準(zhǔn)備

將冷凍干燥機(jī)提前1小時啟動，至冷阱溫度達(dá)到－40 ℃，將已預(yù)凍的標(biāo)本冰箱移到冷阱托盤內(nèi)，密封凍干機(jī)蓋子。在實時監(jiān)控界面，輕觸至預(yù)凍按鈕，將冷量切換至冷阱，待冷阱溫度到－55℃以下維持15分鐘以上，冷阱準(zhǔn)備結(jié)束。

3.2 真空干燥工藝程序

在實時監(jiān)控界面，點(diǎn)擊真空泵關(guān)按鈕，啟動真空泵。待真空泵降到30帕以下后，點(diǎn)擊控溫按鈕，啟動凍干工藝程序控制，升華干燥按預(yù)先設(shè)定的工藝程序運(yùn)行。具體凍干工藝程序如下。

①擱板溫度從－40 ℃升至－30 ℃，在－30 ℃保溫1.5 h；②擱板溫度從－30 ℃升至－20 ℃，在－20 ℃保溫1.5 h；③擱板溫度從－20 ℃升至－10 ℃，在－10 ℃保溫2.5 h；④擱板溫度從－10 ℃升至0 ℃，在0 ℃保溫2.5 h；⑤擱板溫度從0 ℃升至5 ℃，在5 ℃保溫2.5 h；⑥擱板溫度從5 ℃升至10 ℃，在10 ℃保溫2 h；⑦擱板溫度從10 ℃升至15 ℃，在15 ℃保溫1 h；⑧擱板溫度從15 ℃升至20 ℃，在20 ℃保溫1.5 h；⑨擱板溫度從20 ℃升至30 ℃，在30 ℃保溫2.5 h。

最后，打開放水進(jìn)氣閥，使空氣緩慢進(jìn)入冷阱腔（真空度顯示數(shù)字回升），按真空泵開按鈕，使真空泵停止運(yùn)轉(zhuǎn)。關(guān)閉壓縮機(jī)，取出凍干標(biāo)本。

[1] 李朋員, 孫淑玲, 譚屏, 等. 一種大型真菌展示標(biāo)本的制作方法[J]. 生物學(xué)通報, 2012, 47(05): 49.

[2] 吳小杰, 李峻志, 祁鵬, 等. 一種大型真菌標(biāo)本制作方法[P]. 發(fā)明專利（CN104996397A）.

浙江省食用菌種質(zhì)資源庫建設(shè)項目（CTZB-F190830LWZ-SZZZ2）

陳俊良（1985—），男，農(nóng)藝師，主要從事野生菌資源調(diào)查與利用的研究。E-mail：chenjunliang1026@126.com。

陶祥生（1963—），男，農(nóng)藝師，主要從事食用菌栽培技術(shù)研究。

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2095-0934（2020）03-211-02