郭達(dá)，呂松岑

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨四科，黑龍江 哈爾濱 150086)

骨科疾病是一種常見疾病，可由骨科創(chuàng)傷、癌癥或先天性疾病等多種原因引起。自20世紀(jì)90年代初開始，骨組織工程一直致力于開發(fā)新的生物材料，以改善骨修復(fù)和再生。在各種生物材料中，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrices，ECMs)被認(rèn)為是制備骨再生移植物的最佳候選材料之一[1]。ECMs不僅能夠提供結(jié)構(gòu)支持，還能提供多種生物分子，在骨修復(fù)過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞的定植與募集[2]。多項(xiàng)研究表明，骨骼和免疫系統(tǒng)之間通過許多共同的細(xì)胞因子、分子通路以及轉(zhuǎn)錄因子相互作用，這些發(fā)現(xiàn)有助于界定所謂的骨免疫學(xué)領(lǐng)域，其中ECMs調(diào)節(jié)免疫信號已成為研究重點(diǎn)[3]。在這一背景下，目前的研究方向不是為了抑制免疫反應(yīng)，而是通過構(gòu)建ECMs衍生材料來調(diào)節(jié)骨免疫調(diào)節(jié)因子，誘導(dǎo)有利于骨修復(fù)的免疫反應(yīng)[4]。因此，本文對固有免疫在骨修復(fù)中的作用、ECMs成分與固有免疫的關(guān)系、骨修復(fù)中富含內(nèi)外源性免疫調(diào)節(jié)因子的ECMs對固有免疫的調(diào)節(jié)進(jìn)行綜述，并對構(gòu)建具有免疫調(diào)節(jié)性的ECMs進(jìn)行展望。

1 固有免疫在骨修復(fù)中的作用

所有骨替代材料與其他外來結(jié)構(gòu)一樣，在植入后都會(huì)引發(fā)宿主免疫反應(yīng)，這是骨損傷后經(jīng)典免疫反應(yīng)的第一步。因此，了解骨損傷后的免疫反應(yīng)是構(gòu)建骨修復(fù)的免疫誘導(dǎo)材料的關(guān)鍵。

骨損傷后血管破裂會(huì)產(chǎn)生血腫，引發(fā)一系列急性炎癥反應(yīng)，主要由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞參與，激活固有免疫應(yīng)答[5]。多種血液和組織間液蛋白如凝血因子Ⅻ和組織因子吸附到損傷部位，激活凝血級聯(lián)和補(bǔ)體系統(tǒng)[6]。在這種情況下，活化的血小板產(chǎn)生凝血酶原激活物，激活凝血酶原并放大凝血過程。在凝血因子的催化下導(dǎo)致纖維蛋白形成，形成第一批募集免疫細(xì)胞的趨化蛋白基質(zhì)。循環(huán)中的中性粒細(xì)胞很快被趨化蛋白基質(zhì)募集到損傷部位。雖然它們可能導(dǎo)致纖維蛋白凝塊的形成，但其主要作用包括釋放蛋白水解酶、促進(jìn)組織重建、并釋放炎性細(xì)胞因子[如白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1β(macrophage inflammatory protein，MIP-1β)]和募集其他髓系細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)[4]。募集的單核細(xì)胞釋放更多的細(xì)胞因子并分化成巨噬細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞和組織駐留的巨噬細(xì)胞對骨形成有著重要作用[7]，而巨噬細(xì)胞能夠根據(jù)環(huán)境表現(xiàn)出不同的功能表型。最初，骨損傷后的急性炎癥反應(yīng)使巨噬細(xì)胞向活化的M1表型極化，M1巨噬細(xì)胞釋放更多的炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞募集并清除死亡細(xì)胞。在晚期，巨噬細(xì)胞向抗炎的M2表型極化，分泌組織修復(fù)因子[如IL-10、IL-1ra、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血管內(nèi)皮生長因子α(vascular endothelial growth factor α，VEGF α)]發(fā)揮抗炎作用，募集MSCs，促進(jìn)血管生成誘導(dǎo)軟骨內(nèi)骨形成[8]。募集到的MSCs在骨折部位附近分化成軟骨，進(jìn)行軟骨內(nèi)成骨，而直接膜內(nèi)成骨則發(fā)生在骨膜下[9]。與此同時(shí)，它們還發(fā)揮著關(guān)鍵的旁分泌作用，釋放免疫抑制細(xì)胞因子抑制炎癥反應(yīng)。其中骨髓MSCs通過多種途徑(包括Notch和PGE-2信號通路等)抑制固有免疫細(xì)胞的遷移、增殖和分化[10]。因此，骨髓MSCs與巨噬細(xì)胞之間的相互作用對骨修復(fù)至關(guān)重要。

根據(jù)這些原理，一些研究試圖通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞數(shù)量或其向M1、M2表型的極化來改善骨修復(fù)[11]。有報(bào)道稱，一些炎癥信號在骨損傷后的表達(dá)，可顯著促進(jìn)骨修復(fù)。如，TNFα通過誘導(dǎo)骨祖細(xì)胞的募集或成骨細(xì)胞的活化促進(jìn)膜內(nèi)的骨修復(fù)[12]，而IL-1β則促進(jìn)損傷后軟骨內(nèi)骨形成。同樣，IL-6在炎癥過程中也有刺激骨形成的作用[13]。不同的研究表明，抗炎的M2表型巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)MSCs的活動(dòng)，并傳遞骨誘導(dǎo)信號促進(jìn)骨修復(fù)[14]。越來越多的證據(jù)表明M1向M2表型的適當(dāng)轉(zhuǎn)變有利于軟骨內(nèi)成骨的骨修復(fù)[8]。然而，不同的細(xì)胞環(huán)境中信號分子會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向不同的表型極化。這在病理?xiàng)l件下尤為顯著，異常信號可能促使巨噬細(xì)胞向促纖維化表型轉(zhuǎn)變[15]。

2 ECMs成分與固有免疫

許多ECMs成分表現(xiàn)出重要的免疫調(diào)節(jié)特征，可以影響體內(nèi)固有免疫應(yīng)答。例如，膠原纖維是骨組織ECMs的主要組成部分，它與蛋白多糖共同維持了骨組織ECMs的機(jī)械物理特性。然而，膠原纖維可與某些免疫細(xì)胞受體相互作用。例如，巨噬細(xì)胞可以通過其清道夫受體特異性地黏附在Ⅰ型膠原纖維[16]。此外，膠原纖維還可以影響巨噬細(xì)胞樣U937細(xì)胞系上金屬蛋白酶9的分泌[17]。透明質(zhì)酸是天然組織來源ECMs中重要的糖胺聚糖之一，其分子量的不同使透明質(zhì)酸發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)作用也不同。例如，完整的高分子量透明質(zhì)酸具有顯著的抗炎作用，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，而受損的低分子量透明質(zhì)酸可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向炎性表型極化并刺激TNFα表達(dá)[18]。免疫細(xì)胞與透明質(zhì)酸之間的相互作用似乎也是雙向的，因?yàn)閱魏思?xì)胞的激活也可以調(diào)節(jié)其與透明質(zhì)酸的結(jié)合。硫酸肝素是另一種重要的糖胺聚糖，與ECMs蛋白結(jié)合形成蛋白多糖，可以與免疫系統(tǒng)相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、免疫細(xì)胞因子活性和白細(xì)胞遷移[19]。

不僅天然組織來源ECMs成分能調(diào)節(jié)固有免疫，纖維蛋白作為一種合成ECMs的成分，也被證明具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞行為的功能。纖維蛋白原在凝血因子的催化下形成纖維蛋白，參與損傷后血凝塊的形成[20]。已有多項(xiàng)研究報(bào)道，纖維蛋白可根據(jù)其在基質(zhì)中的濃度促進(jìn)或抑制巨噬細(xì)胞的遷移，并抑制巨噬細(xì)胞向炎性表型極化[21]。而纖維蛋白降解產(chǎn)物在體外能夠通過單核細(xì)胞募集白細(xì)胞[22]，還能促進(jìn)單核細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子。

綜上所述，ECMs分子組成決定其內(nèi)在的免疫調(diào)節(jié)特性，因此，對ECMs成分的準(zhǔn)確了解對于進(jìn)一步開發(fā)具有免疫調(diào)節(jié)性的ECMs至關(guān)重要。

3 ECMs整合外源性免疫調(diào)節(jié)因子調(diào)控固有免疫

為了調(diào)節(jié)移植時(shí)的固有免疫反應(yīng)，可直接將細(xì)胞因子導(dǎo)入移植物中。如在小鼠中，將IL-1R1/MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑與纖維蛋白基質(zhì)共價(jià)交聯(lián)，能夠拮抗IL-1β的促炎效應(yīng)，使MSCs向骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨再生[23]。

在骨修復(fù)過程中，免疫細(xì)胞因子依次傳遞，能夠使炎癥反應(yīng)階段向抗炎反應(yīng)階段轉(zhuǎn)變。據(jù)Spiller等[24]報(bào)道，將IFNγ吸附到支架上，并通過生物素-鏈霉親和素結(jié)合IL-4，能夠驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞由M1到M2表型的極化。這些支架在體內(nèi)植入后也能夠促進(jìn)血管生成，進(jìn)一步證明了它們的功能。另一項(xiàng)研究表明，在骨組織修復(fù)中，從納米涂層中釋放出的IL-4能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1向M2型的轉(zhuǎn)變并能促進(jìn)植入物的整合[25]。最近，Schlundt等[8]進(jìn)一步證實(shí)了M2巨噬細(xì)胞在骨修復(fù)過程中誘導(dǎo)軟骨內(nèi)成骨的重要性，在植入截骨模型之前，他們將IL-4和IL-13添加到膠原支架上，從而刺激了M2巨噬細(xì)胞的極化，促進(jìn)了骨修復(fù)。

除了白細(xì)胞介素外，合成肽是ECMs調(diào)節(jié)固有免疫的另一種途徑。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid，RGD)三肽已被證明可以增強(qiáng)骨髓細(xì)胞對ECMs的黏附，并通過整合蛋白的作用誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向抗炎表型極化[26]。白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體-1( leukocyte-associated-lg-like receotor 1，LAIR1)是在多個(gè)免疫細(xì)胞中表達(dá)的一種受體。有研究顯示，與LAIR1結(jié)合的合成肽可以抑制骨髓源性巨噬細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，而只在合成肽連接到支架表面時(shí)才能觀察到這種效應(yīng)[27]。TP508是一種合成的23-氨基酸肽，能通過誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放和血管生成促進(jìn)大鼠股骨骨折模型的骨修復(fù)[28]。用這種材料制成的吸附纖維蛋白原或支架也能引起良好的免疫反應(yīng)，并能改善大鼠骨缺損的成骨能力[29]。

目前有多種途徑將免疫調(diào)節(jié)因子導(dǎo)入ECMs來指導(dǎo)體內(nèi)固有免疫應(yīng)答，但是外源性免疫調(diào)節(jié)因子的傳遞仍有一些缺點(diǎn)，如基質(zhì)穿透性差、擴(kuò)散作用、酶降解、無法控制劑量等。此外，一些特定媒介在體內(nèi)傳遞免疫調(diào)節(jié)因子引發(fā)免疫反應(yīng)也被證明是無效的。因此，我們制定了不同的策略來控制其在時(shí)間及空間的傳遞。其中，通過3D多層系統(tǒng)和智能水凝膠的作用，細(xì)胞因子能夠在ECMs支架按照一定順序釋放[30]。仿生生物材料，如水凝膠，精準(zhǔn)度也已經(jīng)發(fā)展到了分子水平[31]。通過這些技術(shù)，可以設(shè)計(jì)具有免疫特性的ECMs直接靶向作用MSCs和免疫細(xì)胞，使其發(fā)揮生理作用并釋放免疫因子。

4 ECMs驅(qū)動(dòng)宿主細(xì)胞合成內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)固有免疫

為了使ECMs移植物激發(fā)更多的生理免疫反應(yīng)，研究人員嘗試使用多種生物制劑來刺激宿主MSCs或免疫細(xì)胞來傳遞關(guān)鍵的免疫細(xì)胞因子并促進(jìn)骨形成。巨噬細(xì)胞的募集對于清除壞死組織和調(diào)節(jié)骨修復(fù)中的炎癥反應(yīng)是至關(guān)重要的。Kim等[32]使用鞘氨醇-1磷酸酯激動(dòng)劑與富含血小板的血漿結(jié)合，依次誘導(dǎo)炎癥因子(TNFα)和抗炎因子[骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)、IL-10、TGF-β1]的分泌，以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的募集和骨修復(fù)。相反，在富含Ⅰ型膠原ECMs中加入高硫酸化透明質(zhì)酸鈉會(huì)減少IL-1β、IL-8、IL-12和TNFα的分泌，同時(shí)增加巨噬細(xì)胞IL-10和CD163的表達(dá)[33]。

此外，無機(jī)化合物如摻雜鎂的磷酸鈣骨水泥，也能夠誘導(dǎo)固有免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活性，以促進(jìn)骨生成和血管生成。該化合物抑制巨噬細(xì)胞中TNFα和IL-6的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)TGF-β1的表達(dá)[34]。除了巨噬細(xì)胞的活化外，免疫調(diào)節(jié)因子也可以用來調(diào)節(jié)MSCs的行為。例如，RGD三肽和3D透明質(zhì)酸水凝膠的結(jié)合可以影響MSCs整合蛋白的表達(dá)[35]。總之，這些研究試圖通過靶向調(diào)節(jié)內(nèi)源性MSCs和免疫細(xì)胞來促進(jìn)骨再生，從而為骨損傷后的修復(fù)提供關(guān)鍵的線索。

5 總結(jié)和展望

本文回顧了在骨修復(fù)背景下，ECMs與固有免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系。然后重點(diǎn)討論了ECMs成分與固有免疫細(xì)胞之間的相互作用，最后討論了富免疫調(diào)節(jié)因子的ECMs對固有免疫的調(diào)節(jié)。固有免疫在骨損傷后的初始階段發(fā)揮重要作用，如促進(jìn)免疫細(xì)胞募集，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。然而，適應(yīng)性免疫反應(yīng)同樣參與這一調(diào)節(jié)來指導(dǎo)骨形成階段。許多研究試圖設(shè)計(jì)基于ECMs的材料來調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，特別是靶向T細(xì)胞[36]。

我們討論了不同的ECMs成分如何調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答。這些研究表明，ECMs的成分是進(jìn)一步的免疫調(diào)節(jié)工程需要考慮的重要因素。然而，除了其化學(xué)特性外，ECMs的物理特性也可以在體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[37]。因此，富含免疫調(diào)節(jié)因子的ECMs的應(yīng)用應(yīng)與所使用ECMs的物理和化學(xué)特性結(jié)合起來。人們提出了不同的方法來改善生長因子的時(shí)空傳遞，從而設(shè)計(jì)“智能”的ECMs。然而，在大多數(shù)情況下，它們只關(guān)注成骨因子和血管生成因子。未來的研究應(yīng)致力于根據(jù)骨修復(fù)的自然階段協(xié)調(diào)地傳遞成骨因子、血管生成因子和免疫因子。

MSCs的基因操作也已成為一種替代方法，可以更好地控制成骨和血管生成因子在工程化ECMs中的劑量和時(shí)間傳遞，以改善骨修復(fù)過程?；蛐揎椀腗SCs可促進(jìn)骨祖細(xì)胞的分化，直接促進(jìn)骨形成，也可間接促進(jìn)宿主細(xì)胞募集。MSCs過度表達(dá)IL-4和IL-10被認(rèn)為有望成為緩解慢性炎癥(如關(guān)節(jié)炎)和促進(jìn)組織再生的工具[38]。然而，它們產(chǎn)生免疫誘導(dǎo)型ECMs的能力尚未被探索。此外，細(xì)胞系的發(fā)展可能是控制這些關(guān)鍵基因表達(dá)的一個(gè)重要因素[38]。在沒有病毒載體的情況下，有效地將候選基因?qū)爰?xì)胞仍然是一個(gè)公開的挑戰(zhàn)。

近年來，在提高ECMs移植物質(zhì)量和移植后的免疫原性方面取得重要進(jìn)展。在ECMs工程中，免疫調(diào)節(jié)因子可通過在特定的細(xì)胞因子中傳遞或刺激宿主細(xì)胞內(nèi)源性，合成其他因子以豐富生物材料。從這個(gè)角度來看，基因修飾的MSCs代表了一種控制免疫調(diào)節(jié)因子時(shí)空傳遞的選擇，用來設(shè)計(jì)具有免疫調(diào)節(jié)性的ECMs，從而更加有效地促進(jìn)骨修復(fù)。