丘佳明，顧玉蘭，蔣廷旺，魏 煒，林小星，陳志軍

(常熟市第二人民醫(yī)院 1.病理科；2.腫瘤科；3.科技處；4.呼吸內(nèi)科，江蘇 常熟215500)

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均位列所有惡性腫瘤的第一位[1]。肺癌總數(shù)的80%-85%是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，間變性淋巴瘤激酶(ALK)陽(yáng)性NSCLC是肺癌的一種重要分子亞型，占全部NSCLC的3%-7%[2]。近幾年針對(duì)于ALK陽(yáng)性NSCLC的診療研究取得了較大突破，克唑替尼(Crizotinib)、阿來(lái)替尼(Alectinib)、塞瑞替尼(Ceritinib)等ALK酪氨酸激酶抑制劑研發(fā)成功，可明顯提高ALK陽(yáng)性NSCLC患者的客觀緩解率，延長(zhǎng)生存期。因此，精準(zhǔn)檢測(cè)ALK基因狀態(tài)，對(duì)篩選ALK酪氨酸激酶抑制劑的適用患者有決定性的臨床意義。

目前，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局(CFDA)已經(jīng)批準(zhǔn)4個(gè)檢測(cè)方法可以應(yīng)用于ALK檢測(cè)，包括檢測(cè)ALK融合蛋白的免疫組織化學(xué)(IHC)；檢測(cè)DNA水平上ALK基因易位的熒光原位雜交(FISH)；檢測(cè)ALK融合mRNA的即時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)；檢測(cè)ALK易位DNA序列或融合mRNA序列的二代測(cè)序(NGS)。其中FISH被認(rèn)為是ALK陽(yáng)性NSCLC診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[3]，RT-PCR和NGS也均具有較高的靈敏性、特異性和符合率，但是這3項(xiàng)檢測(cè)對(duì)樣本、技術(shù)水平和實(shí)驗(yàn)室要求較高，收費(fèi)昂貴且試劑成本高，大部分中小型病理實(shí)驗(yàn)室尚未開(kāi)展。IHC操作簡(jiǎn)單、收費(fèi)較低，結(jié)果判讀相對(duì)簡(jiǎn)單，適合中小型病理實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。IHC方法檢測(cè)ALK與檢測(cè)其它抗體不同，不同的平臺(tái)和不同的抗體克隆會(huì)有不同的檢測(cè)效果。專(zhuān)家共識(shí)[4]強(qiáng)烈推薦由Roche Bench Mark XT/Ultra自動(dòng)免疫組化染色機(jī)和Roche Ventana生產(chǎn)的克隆號(hào)D5F3的ALK抗體所搭建的平臺(tái)(簡(jiǎn)稱Roche-IHC平臺(tái))。對(duì)于其余的IHC平臺(tái)，專(zhuān)家共識(shí)意見(jiàn)是僅進(jìn)行初篩。本實(shí)驗(yàn)選用我院2019年購(gòu)入并且國(guó)內(nèi)外較多實(shí)驗(yàn)室使用的Leica BOND MAX IHC自動(dòng)免疫組化染色機(jī)和Leica Novocastra生產(chǎn)的克隆號(hào)5A4的ALK抗體組成Leica-IHC平臺(tái)，進(jìn)行NSCLC的ALK檢測(cè)，并與FISH方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集常熟市第二人民醫(yī)院2018年1月至2019年12月肺癌手術(shù)切除、穿刺活檢和纖支鏡活檢標(biāo)本，根據(jù)2015版WHO肺腫瘤分類(lèi)[5]，經(jīng)兩位高年資病理醫(yī)師復(fù)閱切片，確診為原發(fā)且腫瘤細(xì)胞數(shù)多于100個(gè)的NSCLC共197例，包括浸潤(rùn)性腺癌140例和鱗癌57例。所有標(biāo)本在離體后即浸于3.7%中性緩沖甲醛溶液，溶液體積10倍于標(biāo)本體積，固定時(shí)間為6-12 h，規(guī)范取材，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm切片。

1.2 IHC檢測(cè)及判讀標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)儀器為L(zhǎng)eica BOND MAX自動(dòng)免疫組化染色機(jī)。一抗試劑為L(zhǎng)eica Novocastra ALK單克隆抗體(克隆號(hào)5A4)。二抗試劑使用儀器封閉配套試劑，為L(zhǎng)eica Bond Polymer Refine Detection Kit試劑套裝。操作流程按照抗體試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每批檢測(cè)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。結(jié)果判讀參照《常規(guī)免疫組織化學(xué)初篩ALK陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌專(zhuān)家共識(shí)》[6]和抗體說(shuō)明書(shū),具體如下：0(陰性)：所有腫瘤細(xì)胞均無(wú)明顯著色；1+：>5%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)模糊、微弱的細(xì)胞質(zhì)著色，或≤5%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)任何程度的細(xì)胞質(zhì)著色；2+：>5%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)中等程度的細(xì)胞質(zhì)著色；3+：>5%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)程度的細(xì)胞質(zhì)著色。

1.3 FISH檢測(cè)及判讀標(biāo)準(zhǔn)使用CFDA批準(zhǔn)的雅培ALK基因重組檢測(cè)試劑盒(Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit)，原位雜交儀為L(zhǎng)eica Thermo Brite，熒光顯微鏡為L(zhǎng)eica DM2000。操作流程按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。檢測(cè)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為[7]：ALK融合基因無(wú)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞將會(huì)出現(xiàn)橘紅色和綠色信號(hào)重疊融合為黃色，或者相互粘合，即間隔小于兩個(gè)信號(hào)的直徑；ALK融合基因表達(dá)的腫瘤細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)橘紅色和綠色信號(hào)相互分離，即兩個(gè)信號(hào)之間的間距≥2個(gè)信號(hào)直徑；如果腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)一個(gè)融合的黃色信號(hào)和一個(gè)單獨(dú)的橘紅色信號(hào)，也屬于ALK融合基因表達(dá)。以此標(biāo)準(zhǔn)，選取100個(gè)腫瘤細(xì)胞，其中至少有15%出現(xiàn)表達(dá)，可判讀為陽(yáng)性，反之則為陰性。

2 結(jié)果

Leica-IHC共有25例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為12.7%(25/197)(圖1)；FISH共有20例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為10.2%(20/197)(圖2)。Leica-IHC檢測(cè)的25例陽(yáng)性病例中，1+為5例(FISH陽(yáng)性1例)，2+為3例(FISH陽(yáng)性2例)，3+為17例(FISH陽(yáng)性17例)。Leica-IHC檢測(cè)為陰性的病例用FISH方法檢測(cè)也均為陰性。Leica-IHC的敏感度為100%，特異度為97.2%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為80%，陰性預(yù)測(cè)值為100%。對(duì)于Leica-IHC檢測(cè)為3+病例，敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均為100%。

圖2a FISH檢測(cè)ALK在NSCLC的表達(dá)(陽(yáng)性) 圖2b FISH檢測(cè)ALK在NSCLC的表達(dá)(陰性)

3 討論

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代的到來(lái)，對(duì)檢測(cè)精準(zhǔn)性的要求越來(lái)越高，靶向治療成功的前提是通過(guò)可靠的檢測(cè)方法篩選出目標(biāo)人群。對(duì)于NSCLC患者來(lái)說(shuō)，準(zhǔn)確地檢測(cè)ALK是靶向治療的前提。

NSCLC中ALK基因變異主要是ALK基因斷裂后與其它基因進(jìn)行了重排融合，其中棘皮動(dòng)物微管相關(guān)類(lèi)蛋白4(EML4)基因與ALK形成的融合亞型最為常見(jiàn)。ALK的酪氨酸激酶區(qū)域的外顯子和EML4的N末端卷曲螺旋區(qū)域的外顯子相互結(jié)合，形成穩(wěn)定的二聚體，然后通過(guò)自身磷酸化，激活下游PI3K/AKT、RAS/MAPK、JAK/STAT3等通路，引起細(xì)胞異常分化增殖，促進(jìn)NSCLC的發(fā)生和發(fā)展[2]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20多種EML4-ALK融合亞型，其中最常見(jiàn)的亞型有兩個(gè)，一個(gè)是E13;A20亞型(EML4外顯子13與ALK外顯子20融合)，另一個(gè)是E6a/b;A20亞型(EML4外顯子6a/b與ALK的外顯子20融合)，這兩種約占全部亞型的60%[8]。根據(jù)以上的生物學(xué)基礎(chǔ)，ALK酪氨酸激酶抑制劑的研發(fā)和臨床應(yīng)用在近年來(lái)取得了較多成果，明顯提高了EML4-ALK融合基因陽(yáng)性NSCLC患者的客觀緩解率，并且延長(zhǎng)了無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的ALK，即指FISH方法檢測(cè)的EML4-ALK融合基因和IHC方法檢測(cè)的ALK融合蛋白。除了最常見(jiàn)的ALK與EML4融合外，還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了ALK與其它多個(gè)基因的融合變異，包括TFG、KLC1、SOCS5、KIF5B、TPR、H1P1、BIRC6等，這些少見(jiàn)復(fù)雜的融合變異類(lèi)型的臨床意義還需進(jìn)一步研究[9]。

自1988年第一臺(tái)免疫組化儀問(wèn)世，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)推出了幾十種儀器應(yīng)用于臨床，主要有羅氏(Roche)、徠卡(Leica)和丹科(Dako)這3個(gè)品牌[10,11]，共占據(jù)約65%以上的市場(chǎng)份額。本文實(shí)驗(yàn)使用的Leica Bond Max，相比其它兩個(gè)品牌，優(yōu)勢(shì)是Covertiles專(zhuān)利技術(shù)，獨(dú)特的“濕盒”微環(huán)境，側(cè)面滴加試劑，試劑消耗量最小，還可以最大限度減少組織損傷，同時(shí)掉片率也最低，缺點(diǎn)是有標(biāo)本污染可能。相比FISH檢測(cè)，IHC已經(jīng)有了更規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)化流程，更好的技術(shù)穩(wěn)定性，更短的檢測(cè)時(shí)間，更便宜的試劑，而且對(duì)于標(biāo)本沒(méi)有細(xì)胞數(shù)的限制，本實(shí)驗(yàn)全部197例標(biāo)本均獲得了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本文實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒和儀器操作流程,切片整體著色較為鮮艷、核質(zhì)對(duì)比明顯、組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、背景干凈無(wú)雜質(zhì)，檢測(cè)ALK的效果滿意，可以滿足日常臨床需要。

IHC平臺(tái)檢測(cè)效果如何，除了儀器的質(zhì)量之外，試劑的質(zhì)量至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)的ALK抗體主要有D5F3、5A4、ALK1、1A4、SP8這五種克隆[12,13]，其中1A4的特異性偏低(70%)，ALK1的敏感性偏低(67%)，SP8更適用于檢測(cè)間變性大細(xì)胞淋巴瘤，均不推薦常規(guī)使用于NSCLC。關(guān)于5A4和D5F3這兩個(gè)抗體的應(yīng)用，Savic等[14]通過(guò)對(duì)303例NSCLC檢測(cè)，認(rèn)為5A4和D5F3同樣適用于NSCLC的ALK檢測(cè)，Roche Bench Mark和Leica BOND MAX都可用5A4進(jìn)行檢測(cè)。Marchetti等[15]比較了意大利1031例肺腺癌的兩個(gè)IHC平臺(tái)檢測(cè)方法，并以FISH為參照，Roche-IHC檢測(cè)靈敏度、特異性、陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值與Leica-IHC檢測(cè)均近似。Fiset等[16]回顧加拿大5958例肺癌的ALK檢測(cè)結(jié)果及使用ALK酪氨酸激酶抑制劑的生存期，認(rèn)為5A4可作為ALK重排肺癌的一種強(qiáng)有力的診斷方法，并與治療反應(yīng)和生存率相關(guān)。Savic等[17]在另外一項(xiàng)關(guān)于細(xì)胞免疫的研究中，使用Leica-IHC與FISH比較，敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為93.3%、96.0%、93.3%和96%,5A4克隆免疫細(xì)胞化學(xué)的具有高準(zhǔn)確性。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上國(guó)外報(bào)道近似，使用本院新引進(jìn)的Leica-IHC平臺(tái)，以FISH檢測(cè)結(jié)果為參照，Leica-IHC的敏感度為100%，特異度為97.3%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為80%，陰性預(yù)測(cè)值為100%。對(duì)于Leica-IHC檢測(cè)為3+病例，敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均為100%。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以提示：Leica-IHC檢測(cè)為3+病例可判讀為陽(yáng)性，對(duì)于2+和1+病例需FISH方法進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，Leica-IHC檢測(cè)ALK方法可行，應(yīng)用Leica-IHC平臺(tái)進(jìn)行NSCLC患者ALK初篩是有價(jià)值的。