熊 苗，包春玲，周芳芳

(上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院東院 婦產(chǎn)科，上海200123)

胚胎作為母體半同種異體組織抗原未被母體排斥而能成功存活，與母體妊娠免疫耐受有關(guān)。近年來研究顯示，妊娠免疫耐受紊亂在原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)中發(fā)揮至關(guān)重要作用[1]。FTY720是一種從冬蟲夏草中提取的多球殼菌素經(jīng)化學(xué)修飾后的合成物，具有獨特藥理活性，能作用于淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用，并與其他免疫抑制藥物具有協(xié)同作用，在自身免疫性疾病動物模型及器官移植中具有良好應(yīng)用前景[2，3]。FTY720作為1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)受體激動劑，通過拮抗S1P與受體結(jié)合，影響T細(xì)胞分化及功能，參與介導(dǎo)免疫耐受。鑒于FTY720的免疫抑制作用，本課題組前期采用FTY720干預(yù)自然流產(chǎn)孕鼠后能顯著降低孕鼠胚胎丟失率，但其具體機(jī)制尚不明確[4]。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是功能最強的抗原提呈細(xì)胞，在誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受及維持免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究顯示，F(xiàn)TY720對DC細(xì)胞的毒性和吞噬性無明顯影響，但對其表面趨化因子及其受體分泌具有下調(diào)作用[5]。本研究以自然流產(chǎn)孕鼠為研究對象，通過構(gòu)建S1P-siRNA及過表達(dá)S1P慢病毒載體轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞，探討過繼轉(zhuǎn)移兩種慢病毒載體前后FTY720對DC的影響，旨在為臨床治療URSA提供新的治療靶點和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性CBA/J小鼠、雄性DBA/2小鼠和雄性Balb/c小鼠，均為SPF級，6-8周齡，原種購自日本國立遺傳研究所，后由中國科學(xué)院上海實驗動物中心遺傳室保種留存，經(jīng)檢驗遺傳質(zhì)量檢測符合本品系國際標(biāo)準(zhǔn)。于本實驗室無菌條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。本研究經(jīng)上海市第六人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，給予動物人道主義關(guān)懷，實驗過程符合3R原則。

1.2 主要試劑和儀器

FTY 720(上海嘉遠(yuǎn)生物科技有限公司)；S1P過表達(dá)和S1P-siRNA慢病毒載體(上海衛(wèi)藍(lán)海洋材料科技有限公司)；趨化因子受體CCR7、CCL19多抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗小鼠CD80、CD40、CD86、MHCII單抗以及IgG同型對照(美國Biolegend公司)；rmGM-CSF、mIL-4(美國Gibco公司)；流式細(xì)胞儀及分CD1a磁珠抗體(美國BD公司)。

1.3 方法

1.3.1轉(zhuǎn)染DC

DBA/2雄鼠骨髓來源DC分離、培養(yǎng)及鑒定，具體方法同前期研究工作[6-8]；轉(zhuǎn)染S1P過表達(dá)慢病毒載體、S1P-siRNA慢病毒載體的DC結(jié)果及鑒定見前期研究[4]。

1.3.2動物建模及分組

雌性CBA/J小鼠和雄性Balb/c小鼠按2∶1比例合籠，建立正常妊娠孕鼠模型(CBA/J×Balb/c)；雌性CBA/J小鼠和雄性DBA/2小鼠按2∶1比例合籠，建立自然流產(chǎn)孕鼠模型(CBA/J×DBA/2)，合籠后每日8:00和14:00檢查陰道栓，以出現(xiàn)陰道栓為孕1 d。

孕鼠分組：①正常妊娠模型組(CBA/J×Balb/c)，Balb/c雌鼠于合籠前2 d腹腔注射1 mL FTY720，1次/d，連續(xù)2 d；②自然流產(chǎn)模型組(CBA/J×DBA/2)，不干預(yù)；③FTY720組(CBA/J×DBA/2)，CBA/J雌鼠于合籠前2 d腹腔注射1 mL FTY720，1次/d，連續(xù)2 d；④FTY720+S1P-siRNA-DC組(CBA/J×DBA/2)，CBA/J雌鼠于合籠前2 d腹腔注射1 ml FTY720，同時尾靜脈注射1 ml S1P-siRNA-DC(含2.5×106個細(xì)胞)，1次/d，連續(xù)2 d；⑤FTY720+過表達(dá)S1P-DC組(CBA/J×DBA/2)，CBA/J雌鼠于合籠前2 d腹腔注射1 ml FTY720，同時尾靜脈注射1 ml過表達(dá)S1P-DC(含2.5×106個細(xì)胞)，1次/d，連續(xù)2 d；⑥FTY720+空載組(CBA/J×DBA/2)，CBA/J雌鼠于合籠前2 d腹腔注射1 ml FTY720，同時尾靜脈注射1 ml空載慢病毒載體-DC(含2.5×106個細(xì)胞)，1次/d，連續(xù)2 d。

1.3.3計算孕鼠胚胎丟失率[9]

于孕12-14 d，對孕鼠胚胎丟失率進(jìn)行統(tǒng)計。丟失胚胎可見體積縮小、胎盤出血甚至壞死。胚胎體積縮小以胚胎體積<同齡胎盤平均體積減去2個標(biāo)準(zhǔn)差為統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)，胚胎丟失率=丟失胚胎數(shù)/丟失胚胎數(shù)與存活胚胎數(shù)之和×100%。

1.3.4檢測DC數(shù)量及其表面CCR7/CCL19表達(dá)

于孕12-14 d采集孕鼠血樣(眼內(nèi)眥靜脈采血)，頸椎脫臼法處死孕鼠，留取蛻膜，流式細(xì)胞儀檢測外周血和蛻膜組織中DC數(shù)量及其表面CCR7表達(dá)情況，具體方法參照前期研究[10,11]；取胎盤蛻膜組織，制備石蠟切片，按照CCL19抗體免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行染色，檢測趨化因子CCL19表達(dá)情況，染色強度分為4個等級：±，+，++，+++，等級越高代表陽性表達(dá)越多。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測DC凋亡及分化情況

獲取各組孕鼠骨髓來源DC[10,11]，重懸調(diào)整至1×106個/mL，分別加入100 μg/L、50 μg/L的重組GM-CSF和IL-4，于培養(yǎng)3 d、5 d時半量換液，加入細(xì)胞因子，于第5天收集部分細(xì)胞，離心后，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞CD80、CD86、MHC-Ⅱ、CD40表達(dá)，剩余細(xì)胞加入100 μg/L的LPS，48 h后檢測細(xì)胞CD80、CD86、MHC-Ⅱ、CD40表達(dá)。

1.3.6Transwell小室實驗檢測DC趨化能力

趨化實驗：將分離的DC液進(jìn)行重懸，用不含BSA的DMEM培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理過夜，重懸細(xì)胞調(diào)整濃度為1×105～1×106個/mL。將600 μl梯度濃度CCL19溶液加入24孔板，24孔板中放入Transwell小室，小室上室加入200 μl DC懸液(過繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC和過表達(dá)S1P-DC前后與不同濃度的FTY720共培養(yǎng))，5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)20 h，取出小室，多聚甲醛固定(4%)20 min，結(jié)晶紫(0.1%)染色30 min，顯微鏡下觀察并對細(xì)胞計數(shù)，隨機(jī)選取5個視野，以平均值表示。

中和實驗：在上述含CCL19的溶液中，加入1 μg/mL CCL19抗體，于37 ℃條件下孵育1 h，其余步驟同趨化實驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 過繼轉(zhuǎn)移過表達(dá)S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720對孕鼠胚胎丟失率的影響

FTY720干預(yù)后自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率明顯降低(P<0.05)；過繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，F(xiàn)TY720對自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率無明顯影響(P>0.05)；過繼轉(zhuǎn)移S1P-DC后，F(xiàn)TY720能明顯降低自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率(P<0.05)，見表1。

表1 各組孕鼠胚胎丟失率

2.2 過繼轉(zhuǎn)移過表達(dá)S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720對孕鼠外周血DC數(shù)量及CCR7表達(dá)的影響

FTY720干預(yù)后自然流產(chǎn)孕鼠外周血DC數(shù)量及CCR7表達(dá)率較干預(yù)前明顯降低(P<0.05)；過繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，孕鼠外周血DC數(shù)量及CCR7表達(dá)率無明顯變化(P>0.05)，過繼轉(zhuǎn)移過表達(dá)S1P-DC后，孕鼠外周血DC數(shù)量及CCR7表達(dá)率進(jìn)一步降低(P<0.05)，見表2。

表2 孕鼠外周血DC數(shù)量及表面CCR7的表達(dá)

2.3 過繼轉(zhuǎn)移過表達(dá)S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720對孕鼠蛻膜組織中DC數(shù)量及其CCR7表達(dá)的影響

FTY720干預(yù)后自然流產(chǎn)孕鼠蛻膜組織中DC數(shù)量及CCR7表達(dá)率較干預(yù)前明顯降低(P<0.05)；過繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，孕鼠蛻膜組織中DC數(shù)量及CCR7表達(dá)率無明顯變化(P>0.05)，而過繼轉(zhuǎn)移S1P-DC后，孕鼠蛻膜組織中DC數(shù)量及CCR7表達(dá)率進(jìn)一步降低(P<0.05)，見表3。

表3 孕鼠蛻膜組織DC數(shù)量及CCR7的表達(dá)

2.4 過繼轉(zhuǎn)移過表達(dá)S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720對孕鼠蛻膜組織中CCL19表達(dá)的影響

FTY720干預(yù)后自然流產(chǎn)孕鼠蛻膜組織中CCL19表達(dá)較干預(yù)前明顯降低(P<0.05)；在FTY720干預(yù)基礎(chǔ)上過繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，孕鼠蛻膜組織中CCL19表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，而過繼轉(zhuǎn)移過表達(dá)S1P-DC后，孕鼠蛻膜組織中CCL19表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05)，見表4。

表4 孕鼠蛻膜組織中CCL19的表達(dá)

2.5 過繼轉(zhuǎn)移過表達(dá)S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720對DC分化及凋亡的影響

未干預(yù)前DC凋亡率為(8.21±0.25)%，過繼轉(zhuǎn)移過表達(dá)S1P-DC和S1P-siRNA-DC后，DC凋亡率為(8.33±0.33)%、(8.29±0.31)%，提示過繼轉(zhuǎn)移兩種慢病毒前后DC凋亡率無明顯差異(P>0.05)。各組孕鼠DC表面CD80、CD86、MHCII、CD40表達(dá)百分率無明顯差異(P>0.05)。

2.6 趨化實驗和中和實驗結(jié)果

Transwell小室DC數(shù)量隨著FTY720濃度增加而減少(P<0.05)。過繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，DC細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)；過繼轉(zhuǎn)移過表達(dá)S1P-DC后，DC數(shù)量明顯減少(P<0.05)。而加入CCL19抗體后，過繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC或過表達(dá)S1P-DC前后DC數(shù)量無明顯變化(P>0.05)。

3 討論

母胎免疫耐受失衡是URSA的主要發(fā)病機(jī)理，探討誘導(dǎo)免疫耐受的方法可為URSA患者提供新的治療途徑。DC是母胎界面重要免疫活性細(xì)胞，其質(zhì)和量的異常在URSA中發(fā)揮重要作用，URSA患者局部組織中免疫活性細(xì)胞自外周被募集而來，而非由前體細(xì)胞在蛻膜中我更新形成，其中趨化因子及其受體在招募過程中發(fā)揮重要作用[12]。

S1P與受體結(jié)合，可介導(dǎo)淋巴細(xì)胞再分布，F(xiàn)TY720作為S1P受體激動劑，可拮抗S1P與受體結(jié)合，與淋巴細(xì)胞遷移、凋亡以及歸巢密切相關(guān)[13]。本研究以FTY720干預(yù)孕鼠，同時構(gòu)建S1P過表達(dá)和S1P-siRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染DC，觀察過繼轉(zhuǎn)移前后，F(xiàn)TY720對自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率的影響，結(jié)果顯示，F(xiàn)TY720能明顯降低自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率，過繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，F(xiàn)TY720對自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率無明顯影響，過繼轉(zhuǎn)移S1P-DC后，F(xiàn)TY720能明顯降低自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率，與前期研究結(jié)果一致[14]，提示FTY720可能通過阻斷S1P信號通路誘導(dǎo)免疫耐受。

為進(jìn)一步研究FTY720如何通過S1P信號通路影響相關(guān)免疫細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，本研究通過檢測孕鼠外周血和蛻膜局部組織中DC數(shù)量、DC表面CCR7和CCL19表達(dá)及DC凋亡分化情況，結(jié)果顯示，F(xiàn)TY720能明顯減少DC數(shù)量，減少DC表面CCR7和CCL19表達(dá)，過繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，DC數(shù)量明顯增多，而過繼轉(zhuǎn)移過表達(dá)S1P-DC后，DC數(shù)量明顯減少，同時CCR7和CCL19表達(dá)降低，而兩者對DC細(xì)胞凋亡和分化無影響，提示FTY720可能通過抑制DC表面趨化因子及其受體表達(dá)，致使趨化至母胎界面的DC數(shù)量減少，從而誘導(dǎo)免疫耐受，經(jīng)進(jìn)一步趨化實驗驗證，F(xiàn)TY720與DC共培養(yǎng)后DC數(shù)量減少，過繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC后，DC數(shù)量明顯增加，過繼轉(zhuǎn)移過表達(dá)S1P-DC后，DC數(shù)量明顯減少，而加入CCL19抗體后，過繼轉(zhuǎn)移S1P-siRNA-DC和過表達(dá)S1P-DC前后DC數(shù)量無明顯變化，提示FTY720誘導(dǎo)免疫耐受，發(fā)揮降低自然流產(chǎn)孕鼠胚胎丟失率作用，可能是通過阻斷S1P信號通路干擾孕鼠體內(nèi)DC表面趨化因子及其受體表達(dá)，減少母胎界面DC細(xì)胞數(shù)量發(fā)揮免疫抑制作用。