孫 鵬 李歡歡 王衛(wèi)芳 竇 瑤 周曉晶

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130117)

肝癌是最常見(jiàn)的肝臟原發(fā)惡性腫瘤，其致死率極高[1]。尋找抗肝癌免疫中有效靶抗原是抗肝癌免疫的難題[2]。在腫瘤細(xì)胞裂解物(tumor cell lysate,TCL)中含有豐富的腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antibody,TAA)，因此腫瘤細(xì)胞內(nèi)所有抗原都可能是免疫攻擊靶點(diǎn)，從而引起作用更強(qiáng)的抗肝癌免疫反應(yīng)[3，4]。但腫瘤抗原的免疫原性弱，研究者們嘗試了多種方法來(lái)提高TCL的免疫原性。常用的方法包括：用DC裝載 TCL、以HSP為佐劑等[5，6]。Dong等[7]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌的HSP65能協(xié)助lewis肺癌的細(xì)胞裂解物誘導(dǎo)抗肺癌免疫反應(yīng)。此外，人們也研究了含有胞苷酸-鳥(niǎo)苷酸的寡聚脫氧核苷酸(CpG ODN)與肝癌細(xì)胞裂解物聯(lián)合應(yīng)用的效果，CpG ODN是一種Th1型免疫增強(qiáng)劑，刺激機(jī)體產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12等，并且能夠輔助TAA產(chǎn)生CTL反應(yīng)從而清除腫瘤細(xì)胞[8]。Dong等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CpG1826能增強(qiáng)TCL的免疫原性，從而應(yīng)用于人類HPV病毒永生化的腫瘤模型中。因此CpG ODN或許會(huì)輔助TCL誘導(dǎo)抗肝癌免疫。根據(jù)以上推測(cè)，我們將小鼠肝癌細(xì)胞H22的TCL與具有免疫刺激增強(qiáng)作用的C型CpG ODN聯(lián)合應(yīng)用于小鼠原位移植性肝癌模型，研究其抑瘤效果及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 H22細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室液氮冷凍儲(chǔ)存，為懸浮生長(zhǎng)，使用含10%FBS IMDM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中。純化的單鏈寡聚脫氧核苷酸購(gòu)自日本TaKaRa大連分公司(OPC級(jí)，純度90%，HPLC級(jí)，純度99%)。IFN-γ、IL-17檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D System公司。本研究使用的CpG ODN序列如下：C274(5′-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3′)，被溶于無(wú)菌PBS中，紫外分光光度計(jì)定量，檢測(cè)內(nèi)毒素<0.03 EU/mg，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求，于-20℃ 冷藏備用。雌性BALB/c 小鼠，6～8 周齡，18～22 g，購(gòu)自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2方法

1.2.1TCL的制備和鑒定 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H22細(xì)胞用PBS洗滌、計(jì)數(shù)后取適量細(xì)胞制成細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞懸液于37℃水浴和-70℃冰箱中反復(fù)凍融5次，期間震蕩混合20 s。用臺(tái)盼藍(lán)染細(xì)胞并于顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，保證沒(méi)有活細(xì)胞存在。將制備合格的 TCL 放于-70℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2小鼠原位移植性肝癌模型的建立 將 1×107個(gè)H22細(xì)胞注射于BALB/c小鼠腹腔，1周后形成腹水。取腹水分離H22細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以2×106個(gè)細(xì)胞注射于小鼠右后腿外側(cè)皮下。待腫瘤直徑 1 cm 左右分離腫瘤組織于冰冷無(wú)菌PBS中，顯微鏡下將瘤塊剪碎至直徑(1.2±0.2)cm，將瘤塊種植于小鼠肝臟。

1.2.3原位移植性肝癌接種及免疫 BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。在-1 d每只小鼠肝內(nèi)接種肝癌組織，然后于0、7、14、21 d經(jīng)雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)引流區(qū)皮下分別注射PBS、TCL(2×106個(gè)/只)、CpG ODN(12.5 μg/只)和CpG ODN(12.5 μg/只)+TCL (2×106個(gè)/只)，監(jiān)測(cè)小鼠生存期。

1.2.4CTL殺傷實(shí)驗(yàn) 小鼠分組及免疫程序同1.2.3，于末次免疫后7 d，分離小鼠脾細(xì)胞并用TCL刺激培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h時(shí)，加入小鼠IL-2(20 U/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后離心并計(jì)數(shù)。刺激后的脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞， H22細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)。5×105個(gè)脾細(xì)胞稀釋后與靶細(xì)胞共同培養(yǎng)，效靶比分別為12.5∶1、25∶1及50∶1。4 h后收集細(xì)胞并用臺(tái)盼藍(lán)染色，于顯微鏡下觀察存活的細(xì)胞，體積較大的細(xì)胞為H22細(xì)胞并計(jì)數(shù)，每毫升中的細(xì)胞數(shù)=四象限中的細(xì)胞總數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×104，4個(gè)象限的細(xì)胞總數(shù)必須介于200～500個(gè)之間，而且細(xì)胞濃度要超過(guò)104個(gè)/ml。按以下公式確定CTL殺傷情況，CTL細(xì)胞毒性%=(靶細(xì)胞對(duì)照孔細(xì)胞數(shù)-實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞數(shù))/靶細(xì)胞對(duì)照孔細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5Th1型細(xì)胞因子的檢測(cè) 小鼠分組及免疫程序同1.2.3，于末次免疫后7 d，分離小鼠脾細(xì)胞并與TCL共同孵育24 h，收集刺激上清并用IFN-γ和IL-12檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IFN-γ和IL-12的水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有結(jié)果應(yīng)用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行分析，生存曲線用Kaplan-Meier方法繪制；腫瘤發(fā)生率用Fish檢驗(yàn)進(jìn)行比較。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CpG ODN與TCL聯(lián)合應(yīng)用對(duì)小鼠原位移植性肝癌的抑制作用 BALB/c小鼠肝內(nèi)接種瘤塊后，給其注射PBS、TCL、CpG ODN、CpG ODN+TCL，觀察小鼠生存期。結(jié)果如圖1B所示，與其他組相比CpG ODN+TCL組的小鼠生存期明顯被延長(zhǎng)了(P<0.05)，到77 d各組小鼠的存活率分別是PBS組20%、TCL組20%、CpG ODN組10%、CpG ODN+TCL組80%。每只小鼠死亡后分離其腫瘤組織如圖1A所示，CpG ODN+TCL組小鼠10只有2只成瘤并且分別于接瘤后48 d和53 d死亡，其他8只小鼠均未成瘤，這8只小鼠直到77 d全部成活且狀態(tài)良好。而其他各組成瘤率均在80%以上，且相繼死亡。

圖1 CpG ODN+TCL對(duì)小鼠原位移植性肝癌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of CpG ODN+ TCL against orthotopic-transplantated liver cancer in miceNote:A.Tumors in liver from dead mice.PBS.dead/total=8/10,TCL.dead/total=8/10,CpG ODN.dead/total=9/10,CpG ODN+TCL.dead/total=2/10；B.Survival of mice with orthotopic-transplantated liver cancer.*.vs PBS;#.vs CpG ODN;&.vs TCL.

2.2CpG ODN協(xié)同TCL誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng) BALB/c小鼠被隨機(jī)分為4組，末次免疫后7 d，取小鼠脾，CpG ODN組及CpG ODN+TCL組小鼠的脾較其他兩組明顯增大，見(jiàn)圖2A。分離脾細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果如圖2B所示，CpG ODN組及CpG ODN+TCL組小鼠脾細(xì)胞數(shù)分別是1.8×108個(gè)和1.78×108個(gè)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PBS組、TCL組的脾細(xì)胞數(shù)(P<0.05)，但二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 CpG ODN協(xié)同TCL對(duì)小鼠脾的影響Fig.2 TCL adjuvanted CpG ODN induced response of spleen in miceNote:A.Morphology of spleens from three mice after 7 d of the last injection.Sizes of the spleens were compared based on the scale；B.Lymphocyte numbers in spleens from three mice.Each bar represents of lymphocyte number from spleens(down).*.P<0.05 vs PBS group;#.P<0.05 vs TCL group.

2.3CpG ODN協(xié)同TCL誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng) 殺傷結(jié)果如圖3所示，當(dāng)效靶比為分別為25∶1和50∶1 時(shí)，來(lái)源于CpG ODN+TCL免疫鼠的脾細(xì)胞能裂解H22細(xì)胞，裂解率分別為48%和51%，而其他各組均無(wú)裂解效應(yīng)(P<0.05)。

圖3 CpG ODN協(xié)同TCL誘導(dǎo)了CTL反應(yīng)Fig.3 CTL respense induced by CPG PDN+TCLNote:*.vs PBS;#.vs CpG ODN;&.vs TCL.

2.4CpG ODN協(xié)助TCL誘導(dǎo)小鼠分泌Th1型細(xì)胞因子 結(jié)果如圖4所示，CpG ODN+TCL組與CpGODN組產(chǎn)生的IFN-γ 和 IL-12水平均較高，均為PBS組及TCL組的2倍左右(P<0.005)，且兩組間無(wú)差異(P>0.05)。

圖4 CpG ODN協(xié)助TCL誘導(dǎo)小鼠分泌Th1 型細(xì)胞因子Fig.4 Th1 biased cytokines induced by CPG ODN+TCL in miceNote:A.Levels of IFN-γ；B.Levels of IL-12.*.P<0.05 vs PBS group;#.P<0.05,vs TCL group.

3 討論

在TCL制備過(guò)程中本研究組發(fā)現(xiàn)其含有分子量不同的多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)中一定有豐富的腫瘤抗原存在腫瘤抗原的免疫原性弱，不足以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的腫瘤殺傷反應(yīng)。而C型CpG ODN具有強(qiáng)大的免疫刺激作用，作為T(mén)h1型免疫佐劑可增強(qiáng)抗原的免疫原性，研究組也證實(shí)了其能夠協(xié)同TCL有效的抑制原位移植性肝癌的發(fā)生和延長(zhǎng)小鼠的生存期。

本研究組推測(cè)CpG ODN與TCL聯(lián)用對(duì)小鼠原位移植性肝癌的抑制作用與CpG ODN能協(xié)助TCL誘發(fā)特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞有關(guān)。CpG ODN能通過(guò)以下途徑協(xié)同TCL產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)清除肝癌細(xì)胞。第一，本研究組另一個(gè)研究發(fā)現(xiàn)CpG ODN能上調(diào)MHC Ⅰ分子的表達(dá)，從而促進(jìn)TCL遞呈及交叉遞呈[10]。第二，CpG ODN通過(guò)刺激B細(xì)胞和pDC產(chǎn)生IL-12 和 IFN-γ，為T(mén)CL提供Th1免疫環(huán)境,促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h1 CD4+T 細(xì)胞，使CTL浸潤(rùn)到腫瘤位點(diǎn)特異性清除腫瘤細(xì)胞。而且IL-12還能誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌IFN-γ，它能提高肝癌細(xì)胞的MHC分子和共刺激分子的表達(dá)，從而使肝癌細(xì)胞更容易被CTL識(shí)別和清除。本研究中，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用CpG ODN或?qū)⑵渑cTCL聯(lián)用明顯促進(jìn)了小鼠脾細(xì)胞增殖、促進(jìn)了IFN-γ 和 IL-12的分泌，且兩者之間無(wú)差別，說(shuō)明了CpG ODN有強(qiáng)大的免疫增強(qiáng)作用和促進(jìn)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)作用。在進(jìn)一步的CTL殺傷實(shí)驗(yàn)中，CpG ODN能協(xié)助TCL殺傷肝癌細(xì)胞，說(shuō)明CpG ODN促進(jìn)的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)了TCL特異性腫瘤細(xì)胞殺傷反應(yīng)。而單獨(dú)應(yīng)用CpG ODN卻沒(méi)有這樣的作用，說(shuō)明CpG ODN雖能具有免疫刺激作用，但在沒(méi)有腫瘤抗原存在的情況下CpG ODN的免疫刺激引起的非特異性抗腫瘤效應(yīng)不足以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，這也與在抑制腫瘤實(shí)驗(yàn)中CpG ODN與TCL聯(lián)合有抑瘤效果而單獨(dú)使用沒(méi)有效果相統(tǒng)一。說(shuō)明CpG ODN與TCL聯(lián)用的抑瘤效果是通過(guò)誘導(dǎo)了特異性細(xì)胞殺傷反應(yīng)清除腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。