鳳振寧，金世柱

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150081

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是一種由多種原因引起胰腺組織自我消化的無菌性、化學(xué)性炎癥反應(yīng)，臨床癥狀可表現(xiàn)為劇烈腹痛、腹脹、惡心、嘔吐及發(fā)熱等。實(shí)驗(yàn)室檢查提示血清中淀粉酶和脂肪酶水平顯著升高，組織活檢可見胰腺腺泡細(xì)胞的壞死[1-4]。引起AP的原因有很多，其中以過量飲酒和膽石癥最為常見[1-3]，過量飲酒占所有病例的15%～66%，膽石癥為26%～51%。引起AP的其他原因還包括高血脂、自身免疫性疾病、醫(yī)源性、糖尿病、肥胖等[3]。近年來AP的發(fā)病率逐年升高[1,4]，在歐美發(fā)達(dá)國家為4.9/10萬～80/10萬，是消化科常見的住院病例，總體死亡率為2%～5%，有并發(fā)癥者死亡率可達(dá)50%。AP被分為輕度、中度重癥、重癥，其中重癥急性胰腺炎(SAP)的死亡率為30%～50%[1, 4]，多器官功能障礙(MODS)可能是SAP患者死亡的最主要原因[5]，是由于IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的大量釋放引起的。AP的高死亡率、高住院費(fèi)用是由于其發(fā)病機(jī)制尚不明確，缺乏有效的預(yù)防及治療策略。因而研究AP的發(fā)病機(jī)制、藥物治療極其重要，而臨床研究尚存在倫理爭議，動物模型則可以很好地模擬AP的發(fā)病過程，為研究其發(fā)病機(jī)制、藥物治療、預(yù)防護(hù)理等提供很好的研究工具。

1 動物模型

理想的動物模型應(yīng)該有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢：構(gòu)建簡單、易復(fù)制、過程可控，能夠很好地模擬人類疾病。近幾十年來，研究者開發(fā)了多種AP動物模型，并以此在闡明AP的細(xì)胞生物學(xué)和病理生理學(xué)機(jī)制方面取得了很大進(jìn)展。目前常用于構(gòu)建AP動物模型的方法包括：堿性氨基酸[L-精氨酸(L-Arginine, L-Arg)、L-鳥氨酸]、促分泌素、酒精和逆行注射膽汁酸等。

1.1 堿性氨基酸誘導(dǎo)AP動物模型生理?xiàng)l件下，胰腺大量攝取氨基酸以合成胰酶，但高濃度氨基酸聚集會破壞胰腺外分泌腺，誘發(fā)AP。L-Arg是應(yīng)用較為廣泛的用于誘導(dǎo)AP動物模型的堿性氨基酸。L-Arg誘導(dǎo)AP動物模型，通常劑量為2.5～5.0 g/kg L-Arg腹腔注射[6-7]，較高劑量可引起高死亡率，減少劑量會延緩AP的發(fā)病時(shí)間，重復(fù)給藥可促進(jìn)胰腺組織壞死。Zhang等[6]以L-Arg(2.5 g/kg)腹腔注射，可成功誘導(dǎo)大鼠AP模型，并發(fā)現(xiàn)AP模型中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平明顯升高。El-ashmawy等[7]以3.0 g/kg L-Arg腹腔注射成功誘導(dǎo)大鼠AP模型，24 h后處死大鼠，可發(fā)現(xiàn)胰腺組織有明顯的炎細(xì)胞浸潤，伴有嚴(yán)重的組織水腫和血管充血腫脹。AP大鼠模型常用L-Arg濃度為30%，而這種高濃度的L-Arg會造成小鼠模型較高的死亡率[8]。董芳等[9]研究顯示，L-Arg(4.0 g/kg，8%)腹腔注射可成功誘導(dǎo)小鼠壞死性胰腺炎模型，在造模4 d后胰腺細(xì)胞壞死仍較為明顯。對于小鼠而言，L-Arg的有效和致死劑量非常接近，而且不同品系小鼠構(gòu)建模型所需L-Arg的濃度、劑量也不相同。有研究報(bào)道[8]，不同濃度L-Arg對小鼠的作用并不相同，不同品系小鼠對L-Arg的敏感性也不同，L-Arg(2.5～3.0 g/kg，5%～10%)誘導(dǎo)AP小鼠模型時(shí)發(fā)現(xiàn)FVB/n、C57BL/6小鼠的胰腺組織壞死率明顯高于BALB/c小鼠，其原因有待進(jìn)一步研究。L-Arg誘導(dǎo)AP模型暫無明確的機(jī)制，研究顯示可能是由于L-Arg誘導(dǎo)生成大量氧自由基，從而破壞酶原顆粒的穩(wěn)定性，導(dǎo)致大量消化酶釋放，同時(shí)提高NO及炎性介質(zhì)的水平[7]。此外,通過L-Arg-AP模型進(jìn)行研究[10]，發(fā)現(xiàn)胰腺外分泌腺細(xì)胞線粒體功能障礙可能是此類模型成功的核心機(jī)制，研究顯示,L-Arg會導(dǎo)致胰腺線粒體不可逆損傷，而在雨蛙肽(Caerulin,CAE)和牛磺膽酸鈉模型中這種線粒體的損傷是可逆的。Ren等[11]研究也顯示,線粒體功能障礙在AP的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，通過給予實(shí)驗(yàn)動物外源性鳶尾素改善線粒體功能，可以增加實(shí)驗(yàn)動物的存活率并減輕胰腺組織的損傷。L-Arg誘導(dǎo)的AP模型具有較高的重復(fù)性和適用性，應(yīng)用較為廣泛，穩(wěn)定性較強(qiáng)。主要缺點(diǎn)是臨床相關(guān)性較低，僅有少數(shù)病例報(bào)道L-Arg所致人類AP[12]。

L-賴氨酸也被用于誘導(dǎo)AP動物模型，研究顯示[13],腹腔注射L-賴氨酸(2.0 g/kg)可以有效誘導(dǎo)大鼠SAP模型，胰腺腺泡細(xì)胞在處理12 h開始明顯壞死，其機(jī)制可能與L-賴氨酸選擇性損傷胰腺線粒體導(dǎo)致細(xì)胞凋亡有關(guān)。此外,還有L-組氨酸(4.0 g/kg)誘導(dǎo)的AP動物模型[14]，胰腺損傷在24 h達(dá)到峰值但重復(fù)性和適用性尚不清楚。

1.2 促分泌素誘導(dǎo)AP動物模型正常胰腺的代謝與促分泌素的生理濃度相關(guān)，AP是由于促胰液素大量分泌，導(dǎo)致胰腺消化酶分泌過多，引起胰腺自身消化。促分泌素模型最常使用的是CAE，它是一種含有14個(gè)氨基酸殘基的十肽縮膽囊素(CCK)類似物，可以刺激胃腸道激素分泌。CAE通常用于誘導(dǎo)輕度AP模型[15]，此類AP模型的構(gòu)建方法通常為腹腔注射CAE(50 μg/kg)，每次注射間隔為1 h，一般注射6～7次。研究[16]通過連續(xù)腹腔注射CAE(50 μg/kg)7次，可發(fā)現(xiàn)胰腺明顯水腫、炎細(xì)胞浸潤、胰腺組織壞死，并以雙氯芬酸鈉干預(yù)治療，發(fā)現(xiàn)可以明顯改善CAE誘導(dǎo)的AP引起的肺水腫。Hou等[17]以CAE聯(lián)合LPS構(gòu)建SAP模型，實(shí)驗(yàn)方法為腹腔注射CAE (50 μg/kg)共12次，間隔時(shí)間為1 h，最后補(bǔ)充注射一次LPS(15 mg/kg)，發(fā)現(xiàn)胰腺組織出血水腫，可見大量炎細(xì)胞浸潤。與單純應(yīng)用CAE相比，聯(lián)合其他藥物誘導(dǎo)后，實(shí)驗(yàn)動物的胰腺損傷更明顯。目前CAE誘導(dǎo)AP的作用機(jī)制并不明確，可能由于CAE作用于CCK受體，大量胰蛋白酶原被激活為胰蛋白酶，進(jìn)而導(dǎo)致了胰腺的自我消化。CAE誘導(dǎo)快、模型重復(fù)性高、適用性廣、穩(wěn)定性強(qiáng)，此模型經(jīng)常用于評價(jià)AP的全身系統(tǒng)改變。這種模型的主要缺點(diǎn)是單純應(yīng)用CAE多誘導(dǎo)產(chǎn)生輕度AP模型，臨床相關(guān)性有限。

1.3 酒精誘導(dǎo)AP動物模型雖然大量飲酒是引起人類AP的主要原因之一，但動物實(shí)驗(yàn)[18]發(fā)現(xiàn)，酒精單獨(dú)應(yīng)用(靜脈注射或灌喂)，不會使實(shí)驗(yàn)動物的胰腺組織出現(xiàn)明顯的水腫、炎細(xì)胞浸潤、組織壞死等，僅能引起胰腺的微循環(huán)障礙。有學(xué)者[19]用25%乙醇(5 g/kg)飼喂C57BL/6小鼠連續(xù)10 d，才會引起胰腺水腫、中度的纖維化和腺泡萎縮。這些研究均表明了單獨(dú)應(yīng)用酒精來處理實(shí)驗(yàn)動物難以構(gòu)建AP動物模型。酒精源性胰腺炎不單純依靠乙醇的刺激，可能需要其他因素刺激胰腺組織過度分泌。有研究[20]通過腹腔注射乙醇(1.32 g/kg)和棕櫚油酸(1.5 mg/kg)2次/h，24 h可引起實(shí)驗(yàn)動物AP的發(fā)生。其機(jī)制可能是由于棕櫚油酸和乙醇在胰腺中結(jié)合生成脂肪酸乙酯，脂肪酸乙酯是引起AP的一類重要致病毒素，促進(jìn)鈣離子的大量釋放導(dǎo)致腺泡細(xì)胞鈣超載，使線粒體功能障礙甚至大量壞死，誘導(dǎo)產(chǎn)生AP。酒精源性AP模型雖然成本低廉、操作簡單，但需要與外分泌過度刺激相結(jié)合時(shí)，才能誘導(dǎo)AP。

1.4 胰膽管注射膽鹽誘導(dǎo)AP動物模型此模型通常應(yīng)用?；悄懰徕c(sodium taurocholate, ST)誘導(dǎo)產(chǎn)生AP模型，構(gòu)建方法[21-22]通常為開腹并切開十二指腸前壁，由十二指腸壺腹部向胰管注射膽鹽，24 h內(nèi)即可成功誘導(dǎo)SAP模型。 Lin等[22]將5% ST(1 ml/kg)通過0.45 mm直徑的聚乙烯導(dǎo)管逆行注射到SD大鼠胰膽管中，以0.04 ml/min的速度持續(xù)泵入共10 min，可以觀察到胰腺組織水腫、出血、腺泡壞死和炎性細(xì)胞浸潤。并以此模型研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可以減輕胰腺炎性滲出和組織損傷，減少腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，顯著降低大鼠血腦屏障的通透性，減少了繼發(fā)性腦水腫的發(fā)生。此模型經(jīng)過改良后，可將十二指腸切開改為十二指腸穿刺置管[23]，減少了手術(shù)創(chuàng)傷帶來的腸道及局部血管損傷。另外該模型在大型動物實(shí)驗(yàn)中也被成功復(fù)制，有學(xué)者[24]通過逆行胰膽管造影術(shù)在高壓下(100 mmHg)將10 ml濃度為10%和20%的ST注入主胰管誘導(dǎo)產(chǎn)生SAP模型，且胰腺損傷程度與ST呈正相關(guān)。Le等[25]以2.5%～5.0% ST(10 μl/min，5 min)誘導(dǎo)AP小鼠模型時(shí)，同時(shí)結(jié)扎了小鼠的膽總管，組織切片顯示大量腺泡壞死和炎性細(xì)胞浸潤。Cen 等[23]以3.5% ST(2 ml/kg)建立了SAP大鼠模型，并以青蒿琥酯干預(yù)，發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯顯著增加SAP大鼠的存活率，并降低血清淀粉酶和脂肪酶活性，減少IL-1β和IL-6的釋放。同時(shí)發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯降低了Toll樣受體-4(TLR-4)和NF-κB mRNA的表達(dá)，顯示青蒿琥酯可能抑制了TLR-4/NF-κB這一信號通路，以降低消化酶的活性和促炎因子的表達(dá)。 因此，青蒿琥酯可作為潛在治療藥物用于研究SAP的治療。

ST誘導(dǎo)AP是最常用誘導(dǎo)方法之一，模擬了膽總管下段梗阻，臨床相關(guān)性高，與膽源性胰腺炎的發(fā)病過程類似。這種模型多伴有多器官功能衰竭，適用于研究AP的局部和全身并發(fā)癥，可為研究SAP的靶向治療提供工具。此類模型的缺點(diǎn)是死亡率較高，且無法評估注射液引起胰膽管壓力變化對AP的影響。

1.5 胰管結(jié)扎誘導(dǎo)AP動物模型有研究通過結(jié)扎胰管構(gòu)建AP模型[26]，在結(jié)扎后第3天胰腺組織可出現(xiàn)炎性滲出、淋巴漿細(xì)胞浸潤、間質(zhì)水腫、間質(zhì)纖維化和成纖維細(xì)胞增多，在第7天達(dá)到高峰。與人胰腺炎相似，在該模型中過氧化物和NO合酶表達(dá)被上調(diào)。該模型的優(yōu)點(diǎn)是避免了外源性藥物的應(yīng)用引起全身反應(yīng)，避免了外源性藥物對AP自然病程的影響。

1.6 其他方法除以上方法外，還有胰腺被膜下注射法，該模型雖然可以快速建立AP模型，但臨床相關(guān)性低。還有無膽鹽乙硫氨酸模型，該模型價(jià)格昂貴，且僅在雌性小鼠誘導(dǎo)出AP。另外還有電刺激法、高鈣血癥法和高脂血癥性AP模型等。

2 展望

AP動物模型廣泛使用數(shù)十年，大多具有重復(fù)性良好、模型穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但基本均具有劑量、濃度和時(shí)間依賴性，且致病機(jī)制各不相同。研究者可根據(jù)自身的研究需求，選擇合適穩(wěn)定的AP模型。也可不斷改良現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)方法，探索更符合人AP發(fā)病機(jī)制的模型。此外，轉(zhuǎn)基因動物模型也越來越多地用于各種疾病的研究，研究者可探索AP轉(zhuǎn)基因動物模型，以研究遺傳因素等對AP的影響。雖然AP動物模型的臨床相關(guān)性尚存在爭議，但它們使人類對于AP的病理生理機(jī)制的認(rèn)識更加深入。在未來的研究中，動物模型將繼續(xù)成為研究AP不可或缺的工具。