外泌體在骨及軟組織腫瘤中的研究進(jìn)展

劉暢 王華，2

1北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)系（北京100191）；2北京大學(xué)第三醫(yī)院病理科（北京100191）

骨及軟組織腫瘤主要指來源于人體間充質(zhì)的腫瘤。惡性骨及軟組織腫瘤一般統(tǒng)稱為肉瘤，多經(jīng)血道轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性肉瘤患者的總體生存率小于20%［1-2］。肉瘤的治療方法包括手術(shù)、放療和化療。然而，肉瘤演進(jìn)的分子機(jī)制研究相對(duì)緩慢，轉(zhuǎn)移患者的治療效果不盡如人意［1-2］，因此對(duì)于肉瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制及其靶向藥物的研究非常必要。近年來發(fā)現(xiàn)外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移和化療耐藥中發(fā)揮重要作用，部分外泌體中的生物標(biāo)志物可為腫瘤體液診斷和預(yù)后判斷提供幫助，并有望成為腫瘤治療的候選靶標(biāo)［3-4］。這篇綜述將外泌體在不同肉瘤中的研究進(jìn)行總結(jié)，并討論外泌體在肉瘤診斷和治療中的潛在價(jià)值。

1 外泌體概述

外泌體直徑為30～150 nm，由脂質(zhì)雙層膜包繞；膜相關(guān)的脂質(zhì)筏主要由膽固醇、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺和磷脂酰膽堿組成。外泌體胞質(zhì)內(nèi)含有親本細(xì)胞來源的多種成分，包括DNA、mRNA、miRNA、lncRNA 和蛋白質(zhì)［5］，其中蛋白質(zhì)包括膜轉(zhuǎn)運(yùn)及其融合蛋白、與外泌體產(chǎn)生有關(guān)的蛋白質(zhì)（如內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體ESCRT）、腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）表達(dá)蛋白、四跨膜蛋白超家族（tetraspanins）、熱休克蛋白以及不同細(xì)胞來源所特有的蛋白質(zhì)［3］。外泌體的形成過程分為三個(gè)階段：細(xì)胞膜內(nèi)陷形成胞內(nèi)體、胞內(nèi)體多囊泡化、多囊泡體與質(zhì)膜融合釋放外泌體。第一階段中，真核細(xì)胞首先內(nèi)吞形成早期內(nèi)體（early endosome），在高爾基體和ESCRT 等細(xì)胞器和蛋白的調(diào)控下逐漸成熟為晚期內(nèi)體（late endosome），晚期內(nèi)體的包膜通過內(nèi)向出芽作用，包裹特異分選的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)，形成多個(gè)管腔囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），即外泌體前體。晚期內(nèi)體包含多個(gè)ILVs 后，即成為多泡體（multivesicular body，MVB）。MVB 在溶酶體中降解或以外泌體形式分泌到細(xì)胞外間隙［6］。

外泌體的分泌具有較復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，主要受外泌體中蛋白質(zhì)的調(diào)控，包括RAB 及其效應(yīng)分子、GTP 酶以及SNARE（soluble NSF-attachment protein receptor）蛋白家族。RAB家族由60多種GTP 酶組成，分別調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)牟煌h(huán)節(jié)［7］。其中RAB11 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與外泌體分泌有關(guān)的RAB 家族成員，抑制RAB11，細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體數(shù)量減少。此外，外泌體的分泌也可受其他因素影響，如細(xì)胞內(nèi)Ca2+、乙酰肝素酶的表達(dá)或微環(huán)境中pH 值［7］。外泌體遷移到受體細(xì)胞的過程可能依賴于三種機(jī)制：細(xì)胞表面受體與外泌體相互作用、外泌體直接與細(xì)胞膜融合內(nèi)化、外泌體通過內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞［6］。外泌體內(nèi)化除了通過表面蛋白質(zhì)的配體與受體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)外，還可以通過膜上的脂質(zhì)成分來協(xié)助細(xì)胞間通訊傳導(dǎo)并完成內(nèi)化［8］。

人體多種細(xì)胞可產(chǎn)生外泌體，從血液、唾液、尿液等體液中均可檢測(cè)到外泌體［9］。常用的外泌體提取方法有超速離心法、密度梯度離心法、尺寸排阻法、聚合物沉淀法和膜親和法等。其中，超速/密度梯度離心法是分離外泌體較常用的技術(shù)，成本較低，但其離心功效取決于樣品密度等理化性質(zhì)。通過透射電子顯微鏡、Nanosight 或流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)外泌體的大小、含量及質(zhì)量。此外，可調(diào)電阻脈沖傳感技術(shù)或納米顆粒追蹤分析技術(shù)可以測(cè)量外泌體的濃度和粒徑。外泌體中具有相對(duì)特異性的膜相關(guān)蛋白（如CD9、CD63、CD81 和CD82 等跨膜蛋白）、ESCRT、TSG101、熱休克蛋白（如Hsp70 和Hsp90）、黏附分子（如整合蛋白）和膜聯(lián)蛋白等，可通過Western blotting 驗(yàn)證這些蛋白標(biāo)記物［3］。

2 外泌體與骨及軟組織腫瘤

2.1 外泌體在骨及軟組織腫瘤發(fā)生發(fā)展和分化中的作用腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體在其生長(zhǎng)和分化中發(fā)揮重要作用。VENTURA等［10］從培養(yǎng)的尤因肉瘤細(xì)胞外泌體中檢測(cè)到CD99 的表達(dá)，而CD99 參與了尤因肉瘤細(xì)胞分化、遷移和凋亡過程的調(diào)控。CD99 和特異性融合蛋白EWS-FLI1 可通過NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)尤因肉瘤細(xì)胞的分化產(chǎn)生拮抗作用。在CD99 沉默的尤因肉瘤細(xì)胞來源的外泌體中，CD99 表達(dá)缺失，但miR-34a 含量增多，將這種外泌體轉(zhuǎn)染到尤因肉瘤親本細(xì)胞中，可以下調(diào)親本細(xì)胞中Notch1/3 的表達(dá)，影響NF-kB 的轉(zhuǎn)錄活性，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移［10］。DE FEO 等［11］的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CD99 沉默的尤因肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中miR-199a-3p 增多，miR-199a-3p 在野生型尤因肉瘤細(xì)胞系中通過Jun/Fos 通路降低AP-1 轉(zhuǎn)錄因子水平，而AP-1 和NF-kB 活性降低后產(chǎn)生協(xié)同作用，可促進(jìn)受體細(xì)胞的神經(jīng)分化，并抑制受體細(xì)胞的生長(zhǎng)。GHAYAD 等［12］發(fā)現(xiàn)，橫紋肌肉瘤細(xì)胞比正常成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞能產(chǎn)生更多的外泌體，且胚胎型和腺泡型橫紋肌肉瘤細(xì)胞分泌的外泌體均可誘導(dǎo)受體腫瘤細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞增殖，并促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移、血管形成［12］。

2.2 外泌體在骨及軟組織腫瘤微環(huán)境、轉(zhuǎn)移中的作用活化的間質(zhì)細(xì)胞通過釋放趨化因子和生長(zhǎng)因子，使細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積、結(jié)締組織重新構(gòu)建，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲，并可導(dǎo)致化療耐藥［13］。QI 等［14］研究表明，來自人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（hBMSC）產(chǎn)生的外泌體，可通過激活Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。比較兩種外泌體內(nèi)容物，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中，miR-675 的含量比非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤明顯增加［5］，用此外泌體轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞HFOB1.19，后者CALN1 基因表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞遷移和侵襲能力增加［5］，提示腫瘤分泌的外泌體可以作為信使在轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞和周圍細(xì)胞之間傳遞miRNA，重塑骨肉瘤中的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

RAIMONDI 等［2］采用骨肉瘤細(xì)胞來源的外泌體，處理小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病Raw264 細(xì)胞，可以誘導(dǎo)Raw264 細(xì)胞形成多核巨細(xì)胞，并促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的骨吸收活性。用骨肉瘤細(xì)胞外泌體處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），發(fā)現(xiàn)HUVEC中促血管生成因子的表達(dá)增加，促進(jìn)HUVEC形成新生血管。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用骨肉瘤細(xì)胞來源的外泌體處理Raw264 和HUVEC 細(xì)胞后，均能檢測(cè)到miR-148a-3p 和miR-21-5p 表達(dá)增加，提示外泌體可通過特定的miRNA 影響受體細(xì)胞，促進(jìn)破骨細(xì)胞和新生血管形成；兩種miRNA 在骨肉瘤組織樣本中的高表達(dá)均與預(yù)后不良有關(guān)。

卡波西肉瘤（kaposi sarcoma，KS）可攜帶相關(guān)皰疹病毒（KSHV）。HOSHINA 等［15］分離KS 病人及小鼠模型血漿中的外泌體，在這些外泌體中檢測(cè)到了KSHV 特異性miRNA；用這些外泌體轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，IL-6 分泌增多，周圍血管生成潛力增加，肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)加速，Ki67 陽(yáng)性率顯著增高，提示KSHV 中的miRNA可以通過外泌體影響周圍細(xì)胞，反過來再影響腫瘤的進(jìn)展。MCNAMARA 等［16］研究發(fā)現(xiàn)攜帶KSHV的外泌體可通過激活ERK1/2 通路來誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的增殖與遷移，加速卡波西肉瘤的進(jìn)程。含有KSHV 的外泌體長(zhǎng)期轉(zhuǎn)染HUVEC，可以穩(wěn)定促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞重編程，對(duì)這些重編程的HUVEC 細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，MCC、ARFGEF3 等67 種轉(zhuǎn)錄因子顯著上調(diào)，而DKK1、JUNB 等84 種轉(zhuǎn)錄因子顯著下調(diào)［16］，提示外泌體在卡波西肉瘤新生血管形成方面發(fā)揮了重要作用［16］。YOGEV 等［17］發(fā)現(xiàn)，受KSHV 感染的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體可將病毒miRNA 轉(zhuǎn)移到鄰近細(xì)胞中，并且可下調(diào)受體細(xì)胞靶基因表達(dá)，如抑制EGLN2 和HSPA9基因表達(dá)來促進(jìn)有氧糖酵解，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生有氧糖酵解，使其對(duì)KSHV 的敏感性降低，阻止KSHV進(jìn)一步擴(kuò)散，為KSHV 在微環(huán)境中的富集提供了條件。

腫瘤分泌的外泌體可以選擇性地將信息轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的受體細(xì)胞，改變局部微環(huán)境，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的相關(guān)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。ENDO-MUNOZ 等［18］根據(jù)轉(zhuǎn)移特性分出一組骨肉瘤細(xì)胞系，在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系KHOS 中，尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）-尿激酶型纖溶酶原激活物受體（uPAR）軸的高表達(dá)與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移行為密切相關(guān)，且不依賴于Ras 基因的表達(dá)。對(duì)KHOS 細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行超速離心，在外泌體沉淀和上清液中均檢測(cè)到uPA 的存在，證明uPA 以可溶形式分泌，并作為骨肉瘤分泌的細(xì)胞外囊泡（包括外泌體）的蛋白質(zhì)載體的一部分，通過uPA/uPAR/MAPK 軸激活MAPK 信號(hào)來促進(jìn)骨肉瘤轉(zhuǎn)移［18］。

BAGLIO 等［19］發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞來源的外泌體可以通過激活間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）中的IL-6/STAT3通路促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，而這一過程可以被IL-6 阻斷劑逆轉(zhuǎn)［19］。WANG 等［20］發(fā)現(xiàn)癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）分泌的外泌體中miR-1228 上調(diào)，將CAF 來源的外泌體轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞，可以下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中的腫瘤細(xì)胞侵襲抑制因子（suppressor of cancer cell invasion，SCAI）的mRNA 和蛋白質(zhì)水平，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

唾液酸酶（NEU1）是細(xì)胞內(nèi)溶酶體胞吐作用的負(fù)向調(diào)節(jié)分子，而溶酶體相關(guān)膜蛋白1（LAMP1）則是該過程的活化分子。如果NEU1 缺乏，LAMP1 則保持高度唾液酸化并聚集在溶酶體膜上，使溶酶體易結(jié)合于質(zhì)膜上，有利于溶酶體的胞吐作用［21］。MACHADO 等［21］在橫紋肌肉瘤的研究中，比較了兩種人橫紋肌肉瘤RH41 和RH30 細(xì)胞系中NEU1和LAMP1 的表達(dá)情況，RH41 中NEU1 呈高表達(dá)而LAMP1 呈低表達(dá)，RH30 細(xì)胞則相反。在RH30 細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)較多的溶酶體結(jié)合于質(zhì)膜上，并顯示出明顯的胞吐現(xiàn)象。通過超速離心法分別提取兩種細(xì)胞的外泌體，發(fā)現(xiàn)RH30 細(xì)胞能產(chǎn)生更多的外泌體［21］，進(jìn)一步在RH41 和RH30 細(xì)胞中分別敲低和過表達(dá)NEU1 或LAMP1 基因，可以通過下調(diào)NEU1 或上調(diào)LAMP1 表達(dá)來增強(qiáng)溶酶體胞吐作用和外泌體釋放。在RH30 細(xì)胞分泌的外泌體存在的情況下，RH41 細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，但沉默LAMP1 的RH30 細(xì)胞分泌的外泌體則對(duì)RH41 細(xì)胞沒有類似效果。為進(jìn)一步探討橫紋肌肉瘤進(jìn)展的機(jī)制［21］，在肉瘤細(xì)胞中下調(diào)NEU1、上調(diào)LAMP1 基因的表達(dá)，再進(jìn)行基因表達(dá)陣列分析；結(jié)果顯示，肌球蛋白-11（MYH11）基因表達(dá)上調(diào)，并且MYH11可以與LAMP1 協(xié)同作用，促進(jìn)溶酶體的胞吐作用。此外，溶酶體胞吐作用和外泌體釋放增加可以降解人和小鼠肉瘤細(xì)胞周圍的細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)侵襲［21］，也提示外泌體在橫紋肌肉瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

2.3 外泌體在骨及軟組織腫瘤診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)中的作用外泌體可以保護(hù)RNA 等內(nèi)容物免受人體血漿中RNA 酶的降解，使其在循環(huán)血中保持一定的穩(wěn)定性［22-23］。不同來源外泌體攜帶了親本細(xì)胞的核酸或蛋白質(zhì)信息，可以據(jù)此判斷來源腫瘤的類型，被認(rèn)為是細(xì)胞外液或體液中理想的生物標(biāo)志物。此外，外泌體產(chǎn)生的數(shù)量與某些腫瘤的惡性程度正相關(guān)，可輔助進(jìn)行預(yù)后預(yù)測(cè)［9］。MILLER等［22］在尤因肉瘤細(xì)胞來源的外泌體中檢測(cè)到NROB1、NKX2.2、STEAP1、LIPI 及EWS-FLI1 融合基因等12 種潛在的分子標(biāo)志物，qRT-PCR 結(jié)果驗(yàn)證了上述基因在外泌體中的表達(dá)具有一定的特異性，其中EWS-FL1 融合基因的出現(xiàn)說明尤因肉瘤細(xì)胞分泌的外泌體中含有較完整的mRNA，可成為尤因肉瘤體液診斷及監(jiān)測(cè)的特異性分子標(biāo)志物。在尤因肉瘤細(xì)胞外泌體中有超過1 200個(gè)轉(zhuǎn)錄物與對(duì)照組明顯不同，這些轉(zhuǎn)錄物在尤因肉瘤細(xì)胞衍生的外泌體中高度富集或減少，可能作為尤因肉瘤細(xì)胞和微環(huán)境通訊的相關(guān)介質(zhì)發(fā)揮作用［22］，其中部分有望成為鑒別診斷和預(yù)后判斷的候選分子標(biāo)志物。

除特異性融合基因外，外泌體中的一些特異性蛋白和核酸也可以協(xié)助診斷、鑒別診斷及預(yù)后判斷［23］。FUJIWARA 等［4］發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血漿外泌體中的miR-25-3p 的濃度顯著高于非骨肉瘤患者和健康志愿者。由于miR-25-3p 可以在外泌體中穩(wěn)定存在，因此檢測(cè)血漿中miR-25-3p 水平是區(qū)分骨肉瘤患者、非骨肉瘤患者或健康人群有效的生物標(biāo)志物之一。此外，血漿miR-25-3p 水平與骨肉瘤患者的預(yù)后相關(guān)，miR-25-3p 水平越高，患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性越大，因此miR-25-3p 的血漿水平也可以作為骨肉瘤的預(yù)后判斷指標(biāo)［4］。

有研究發(fā)現(xiàn)滑膜肉瘤來源的外泌體中miR-92b-3p 穩(wěn)定表達(dá)［24］，與對(duì)照組相比，miR-92b-3p 水平在滑膜肉瘤細(xì)胞系培養(yǎng)基中含量顯著增高，并與腫瘤細(xì)胞數(shù)量和培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)。在小鼠血清中發(fā)現(xiàn)miR-92b-3p 水平與滑膜肉瘤大小有關(guān)。進(jìn)一步對(duì)滑膜肉瘤患者和對(duì)照組的miR-92b-3p 水平進(jìn)行分析，證實(shí)血清miR-92b-3p 水平與腫瘤大小相關(guān)；當(dāng)腫瘤被切除和輔助化療后，血清miR-92b-3p 水平降低，但在局部復(fù)發(fā)或肺部轉(zhuǎn)移的患者中逐漸升高。由于主要存在于腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體中的miR-92b-3p 比較穩(wěn)定，因此，循環(huán)血外泌體中的miR-92b-3p 可作為監(jiān)測(cè)滑膜肉瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的新型生物標(biāo)志物［24］。此外，與其他骨及軟組織腫瘤相比，miR-92b-3p 水平在滑膜肉瘤呈特異性上調(diào)，因此也可以用于與其他骨軟組織肉瘤的鑒別診斷［24］。

CASADEI等［25］發(fā)現(xiàn)脂肪肉瘤患者血漿中有3種miRNA（miR-25-3p、miR-451a、miR-92a-3p）表達(dá)上調(diào)，而miR-199a-3p 表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步對(duì)比來自多個(gè)不同脂肪肉瘤細(xì)胞系和正常脂肪組織的外泌體miRNA［25］，發(fā)現(xiàn)miR-25-3p 和miR-92a-3p 在所有脂肪肉瘤細(xì)胞系的外泌體中明顯上調(diào)。隨后將患者和健康組血漿中的外泌體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-25-3p 和miR-92a-3p 在脂肪肉瘤患者血漿的外泌體中含量升高。當(dāng)脂肪肉瘤細(xì)胞與外泌體抑制劑共培養(yǎng)時(shí)，miR-25-3p 和miR-92a-3p 的表達(dá)水平也降低，證明血漿中miR-25-3p和miR-92a-3p主要是脂肪肉瘤細(xì)胞通過外泌體產(chǎn)生的［25］，受試者工作特征（ROC）曲線分析顯示［25］，這兩種miRNA特異性較高，有望成為新的脂肪肉瘤輔助診斷的分子標(biāo)志物。

COLLETTI 等［26］發(fā)現(xiàn)促結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤（DSRCT）患者血漿外泌體中有55 種miRNA含量顯著不同，其中14 種miRNA 含量在至少1 例患者血漿外泌體中明顯不同，在3 例患者的血漿外泌體中發(fā)現(xiàn)有3 種miRNA 表達(dá)上調(diào)（miR-34a-5p、miR-22-3p 和miR-324-5p）、2 種miRNA 表達(dá)下調(diào)（miR-150-5p 和miR-342-3p），說明富含miRNA的血漿外泌體可成為DSRCT 患者潛在的輔助診斷標(biāo)志物。

液體活檢具有微創(chuàng)、快速、容易重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，從血液、尿液、唾液或腦脊液中分析游離核酸、可溶性蛋白質(zhì)等已成為腫瘤活檢的重要輔助檢測(cè)方法［27］。與組織活檢相比，液體活檢可以更好地監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、預(yù)測(cè)化療后反應(yīng)、實(shí)時(shí)了解腫瘤耐藥演變、確定靶向治療的方向［9］。由于外泌體中富含腫瘤細(xì)胞來源或衍生的各種蛋白質(zhì)、核酸等成分，將成為液體活檢又一新的方向［3］。

2.4 外泌體在骨及軟組織腫瘤治療中的作用

2.4.1 外泌體與骨及軟組織腫瘤的免疫治療由于外泌體含有來自腫瘤細(xì)胞的抗原并參與免疫應(yīng)答，所以外泌體可能成為免疫治療的靶標(biāo)。TSUNO 等［28］發(fā)現(xiàn)，滑膜肉瘤SW982 細(xì)胞系的外泌體中含有的蛋白質(zhì)數(shù)量大約是親本細(xì)胞的三分之一。用柳氮磺吡啶（SASP）和甲氨蝶呤（MTX）處理后，SW982 細(xì)胞來源的外泌體和親本細(xì)胞的蛋白質(zhì)譜變化明顯不同；表明外泌體中的內(nèi)容物不僅僅是親代細(xì)胞的簡(jiǎn)單輸出［28］，而是在形成和分泌過程中發(fā)生了不同程度的變化。SASP 和MTX 通過抑制IL-1β可以影響SW982 細(xì)胞外泌體的蛋白質(zhì)譜構(gòu)成。在外泌體中觀察到兩種發(fā)生變化的功能組蛋白質(zhì)，一種為免疫系統(tǒng)相關(guān)蛋白，包括與免疫抑制相關(guān)的蛋白，如Ras 相關(guān)蛋白R(shí)ab-7b、GTP 結(jié)合核蛋白R(shí)an；另一種為氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白，如3-磷酸甘油醛脫氫酶、NAD（P）H 脫氫酶1、硫氧還蛋白相互作用蛋白；其中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白對(duì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。外泌體中的這兩組蛋白質(zhì)中的部分可在IL-1β的作用下含量降低，SASP 和MTX 則可通過抑制IL-1β使這些蛋白含量增加，其中的免疫系統(tǒng)相關(guān)蛋白可有望成為未來免疫治療的候選靶標(biāo)［28］。

2.4.2 外泌體與藥物呈遞系統(tǒng)將外泌體用于腫瘤藥物治療的載體傳遞系統(tǒng)已成為外泌體研究的一大熱點(diǎn)。相對(duì)于脂質(zhì)體和基于蛋白質(zhì)的納米粒子，外泌體具有如下優(yōu)勢(shì)：（1）體內(nèi)分布廣泛，具有明顯生物相容性，可將藥物直接裝載在經(jīng)過純化的外泌體中，并且親脂性和親水性物質(zhì)均可以通過不同的方法加載到外泌體中；（2）可對(duì)生物源性或合成物質(zhì)的藥物進(jìn)行分類遞送；（3）選擇合適親本細(xì)胞釋放的外泌體可以優(yōu)先被特定受體細(xì)胞內(nèi)化［29］；（4）選擇特異性外泌體膜修飾蛋白或脂質(zhì)可以使其被特定的靶細(xì)胞內(nèi)化［8］；（5）可以在外泌體產(chǎn)生和分泌過程中完成靶向遞送，如將藥物注入親本細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⒅委熡玫腄NA 轉(zhuǎn)染親本細(xì)胞，所產(chǎn)生的外泌體中即含有相應(yīng)的藥物；理想的親本細(xì)胞可以分泌大量攜帶藥物的外泌體，這些外泌體不僅可以誘導(dǎo)非免疫應(yīng)答，還可以靶向定位于特定的受體細(xì)胞。

SHIMBO 等［30］發(fā) 現(xiàn) 在轉(zhuǎn)染miR-143 的MSC 的條件培養(yǎng)基中，骨肉瘤細(xì)胞中miR-143 的表達(dá)水平顯著增高，細(xì)胞遷移能力明顯降低，提示miR-143可以對(duì)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。通過超速離心法分離轉(zhuǎn)染后MSC 的條件培養(yǎng)基中的外泌體，與單純的條件培養(yǎng)基進(jìn)行比較，前者miR-143 的水平高于后者，提示細(xì)胞外液中多數(shù)miR-143 存在于外泌體中［30］。此外，與未被轉(zhuǎn)染的MSC 相比，轉(zhuǎn)染miR-143 后的MSC 細(xì)胞外囊泡分泌量更高；并且從這種培養(yǎng)基中分離出的外泌體或未分離的條件培養(yǎng)基均可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力，但去除外泌體的條件培養(yǎng)基中未能觀察到143B 細(xì)胞遷移受到抑制的現(xiàn)象。這些結(jié)果顯示細(xì)胞外miR-143 主要位于外泌體中并發(fā)揮抑制作用［30］。外泌體的遞送效率雖低于脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法，但外泌體遞送的毒性反應(yīng)較小，抑制腫瘤遷移的效應(yīng)相似。推測(cè)外泌體中的miR-143 可能被整合到其他復(fù)合物（如Ago2 蛋白）中，并被有效地轉(zhuǎn)送至受體細(xì)胞相應(yīng)位置，直接作用于靶點(diǎn)，提高了miR-143 的利用效率［30］。外泌體作為潛在的藥物呈遞系統(tǒng)的作用機(jī)制還在進(jìn)一步研究中。

WEI 等［29］從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC）中分離出外泌體，將其與鹽酸阿霉素（Dox-HCl）混合，用三乙胺和磷酸緩沖鹽溶液（PBS）處理后，獲取裝載阿霉素（Dox）的外泌體（Exo-Dox）。透射電子顯微鏡顯示Exo-Dox 有明顯的外泌體結(jié)構(gòu)。用納米顆粒追蹤分析，發(fā)現(xiàn)裝載Dox 前，外泌體直徑為112.4 nm 左右，裝載Dox 后，外泌體直徑增大為152.7 nm 左右，-20 ℃培養(yǎng)7 d，Exo-Dox 的大小無明顯變化［29］。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境可以加速Exo-Dox 的Dox 釋放，而腫瘤細(xì)胞中的晚期內(nèi)體和溶酶體往往呈嗜酸性，提示Exo-Dox 可能成為有效的治療腫瘤的靶向藥物［29］。由于Dox 的主要副作用是心臟毒性，用游離Dox 和Exo-Dox 分別轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)進(jìn)入心肌細(xì)胞中的Exo-Dox 數(shù)量比游離Dox 明顯減少，反之，Exo-Dox 進(jìn)入到骨肉瘤細(xì)胞核中的數(shù)量明顯多于對(duì)照組，提示Exo-Dox 可以更加有效地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑制作用，而對(duì)心肌細(xì)胞的毒性較小。此外，將BM-MSC 產(chǎn)生的外泌體與骨肉瘤細(xì)胞和心肌細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，細(xì)胞活力仍保存92%，證明外泌體有較好的細(xì)胞相容性［29］，并提示從BM-MSC 分離出的外泌體適合作為藥物載體運(yùn)載化療藥物。

2.4.3 外泌體與化療效果評(píng)估、腫瘤耐藥外泌體中部分miRNA 的含量可隨化療效果發(fā)生改變。XU 等［1］分析了骨肉瘤患者化療中的外泌體miRNA 變化情況，發(fā)現(xiàn)部分miRNA 的表達(dá)隨著化療效果不同而有所不同。如化療效果差時(shí)，外泌體中的miR-124、miR-133a、miR-135b、miR-148a、miR-199a-3p、miR-27a、miR-385 和miR-9 等的含量下降。因此，骨肉瘤外泌體miRNA 有望作為判斷化療效果的生物標(biāo)志物，并據(jù)此來制定和重新評(píng)估化療方案。

外泌體分泌的某些物質(zhì)也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞之間的耐藥性轉(zhuǎn)移。TORREGGIANI 等［31］分離出具有多重耐藥性的人骨肉瘤細(xì)胞MG-63DXR30 的外泌體（Exo/DXR）、無耐藥性的MG-63 細(xì)胞的外泌體（Exo/S）。用Exo/DXR 感染骨肉瘤細(xì)胞可降低細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，而用Exo/S 感染骨肉瘤細(xì)胞則不會(huì)改變細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性［31］。此外，具有阿霉素抗性的骨肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可以被攝入無藥物抗性的MG-63 細(xì)胞，并誘導(dǎo)受體細(xì)胞出現(xiàn)阿霉素抗性的表型。P-糖蛋白（P-gp）是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它是MDR-1 基因編碼的ATP 結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體的成員，可依賴ATP 將細(xì)胞內(nèi)藥物排出，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，腫瘤細(xì)胞繼續(xù)存活。Exo/DXR與Exo/S 相比，前者表達(dá)更高水平的MDR-1 mRNA和P-gp，而被Exo/DXR 轉(zhuǎn)染后，MG-63 細(xì)胞中MDR-1 mRNA 和P-gp 表達(dá)水平均升高［31］，提示外泌體可以通過其內(nèi)在的mRNA 或蛋白質(zhì)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的耐藥性轉(zhuǎn)移。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

大多數(shù)骨及軟組織腫瘤的發(fā)病機(jī)制還不十分明確，尚無有效的靶向治療藥物。近年來，外泌體在骨及軟組織腫瘤中的研究日趨增多，包括外泌體在肉瘤發(fā)生發(fā)展、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、靶向治療和輔助診斷中的作用，這些研究為揭示骨及軟組織腫瘤的演進(jìn)機(jī)制和潛在治療方式提供了重要線索。未來關(guān)于外泌體的研究可能集中在以下幾個(gè)方面：（1）繼續(xù)深入了解外泌體的生物學(xué)結(jié)構(gòu)、內(nèi)容物和分泌方式；（2）尋找更為簡(jiǎn)捷、有效的純化和檢測(cè)外泌體的方法；（3）建立能反映病理生理狀態(tài)下外泌體功能研究的條件；（4）明確外泌體用于體液活檢、并作為診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)的可行性；（5）優(yōu)化外泌體的靶向輸送系統(tǒng)，尋找有效途徑使外泌體與其他抗腫瘤藥物協(xié)同發(fā)揮作用。對(duì)外泌體的深入研究，將為骨及軟組織腫瘤的診斷、預(yù)后判斷和治療等帶來新的方向。