馮 勁， 彭如群， 施慶珊， 謝小保

廣東省微生物研究所 廣東省科學(xué)院 華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070

細(xì)菌纖維素(BC)這種來源于細(xì)菌的高分子材料，具有一般纖維素的特點(diǎn)同時(shí)，還具有許多獨(dú)特的性質(zhì)。(1)BC具有極為精致的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),正由于這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使BC具有很高的結(jié)合水能力;(2)BC的微纖維比植物來源的細(xì)，因此其表面積要比植物纖維大，具有更高的化學(xué)吸附能力;(3)較好的機(jī)械性能，其具有高彈性，高回彈性及高拉伸強(qiáng)度[1-3]。 因此BC可用于制備敷料和包裝材料。然而，BC并不具有抗菌作用。

納米金屬顆粒已經(jīng)用于抗菌殺菌劑領(lǐng)域。而納米氧化鋅(ZnO)被認(rèn)為是低毒的，環(huán)保的，較好的生物安全性的和生物相容性[4]。ZnO對廣泛的微生物表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗菌活性。它們抑制微生物酶，例如脫氫酶，谷胱甘肽還原酶和硫醇過氧化物酶，以顯示出顯著的抗菌性能[5]。本研究針對BC負(fù)載上納米ZnO，使其具有抗菌性。表面活性劑是兩性分子，可降低表面和界面張力。在水溶液中形成球形膠束可以防止納米顆粒聚集，控制納米顆粒的大小[6]。因此本研究還探索在制備BC-ZnO過程中添加表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)對細(xì)菌纖維素負(fù)載納米氧化鋅復(fù)合物(BC-ZnO)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：葡萄糖、醋酸鋅、氫氧化鈉、Triton X-100等藥品均為分析純。

儀器: 攪拌器、微波化學(xué)合成儀、空氣搖床、培養(yǎng)箱等。

培養(yǎng)基：SH培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨 5，酵母膏 5，Na2HPO4·12H2O 2.7，檸檬酸 1.5，pH=5.0。

A9培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 40，酵母膏 1，蛋白胨 7，Na2HPO4·12H2O 8，玉米漿 6，乙酸 1 mL/L，乙醇 14 mL/L，pH=6.0。

NA培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

菌株：GluconacetobacterintermediusBC-1細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC8739、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC6538p和白假絲酵母菌(Candidaalbicans)ATCC10231均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 BC的制備

取一環(huán)活化好的斜面菌種BC-1接種入SH培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)24 h，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min。以10%的接種量接入A9培養(yǎng)基，分裝入24孔板中，28 ℃靜置培養(yǎng)7 d。取出細(xì)菌纖維素凝膠(BC)，去離子水多次沖洗，除去膜表面雜質(zhì)及殘余的培養(yǎng)基。 再將凝膠浸入0.1 mol/L的 NaOH 溶液中，100 ℃水浴至凝膠呈乳白色半透明狀。然后用去離子水反復(fù)沖洗，使BC pH為7.0。

1.3 BC-ZnO的制備

3.3 g二水合醋酸鋅溶于15 mL去離子水中，分別加入Triton X-100 0、0.1、1 mL。將純化后的BC用吸水紙吸干表面水分后，放入上述溶液中37 ℃振蕩。振蕩24 h后，取出BC放入50 mL去離子水中，再滴加入50 mL 1 mol/L NaOH溶液，不斷攪拌。將上述體系轉(zhuǎn)移入微波反應(yīng)罐中，微波加熱至180 ℃，反應(yīng)1 h，得到BC-ZnO(體系中加入Triton X-1000、0.1和1 mL，制備得到BC-ZnO分別命名為BC-ZnOT0、BC-ZnOT0.1和BC-ZnOT1)反應(yīng)后，取出BC-ZnO用去離子水將其沖洗至中性。

1.4 納米復(fù)合材料的表征

采用射線衍射儀(XRD，D/max1200,日本)從2θ為10°記錄到95°觀察復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。用0.5 mol/L 硝酸消解BC-ZnO，采用鋅測定試劑盒(鋅汞比色法)(南京建成生物工程研究所有限公司)測BC-ZnO中Zn的含量。液氮中迅速冷凍結(jié)實(shí)BC-ZnO，再進(jìn)行冷凍干燥，采用日立H-3000N 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察BC-ZnO中ZnO在BC中的分布。采用液氮中迅速冷凍結(jié)實(shí)BC-ZnO，立刻研磨。再用無水乙醇重懸分散，采用日立H-7650 透射電子顯微鏡(TEM)觀察BC-ZnO中ZnO粒徑大小。利用Image J測量電鏡圖中100個(gè)以上的ZnO微粒，以較長的直徑為統(tǒng)計(jì)對象，并統(tǒng)計(jì)出其粒徑分布情況。

1.5 抗菌性能測試

將BC-ZnO在80 ℃烘干，裁剪出直徑約為6 mm的小圓片。分別制作含106CFU/mL 的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的NA平板和含106CFU/mL 的白假絲酵母菌的沙氏平板，將BC-ZnO的小圓片貼在平板上，置于37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察是否有抑菌圈，同時(shí)用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑。

2 結(jié)果

2.1 物相分析

2.1.1XRD表征

用X射線衍射(XRD)分析樣本的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖1為BC-ZnOT0、BC-ZnOT0.1和BC-ZnOT1的XRD圖。發(fā)現(xiàn)它們都在22.69o、31.75o、34.44o、36.25o、47.54o、56.55o、62.87o、66.39o、67.92o、69.06o、72.61o、76.96o、81.41o、89.63o和92.77o出現(xiàn)特征峰。其中2θ=22.69o為纖維素的特征峰[7]。而31.75o、34.44o、36.25o、47.54o、56.55o、62.87o、66.39o、67.92o、69.06o、72.61o、76.96o、81.41o、89.63o和92.77o為ZnO的特征峰[8]。表明ZnO成功載入纖維素中。也反映出ZnO載入BC中與Triton X-100的添加無關(guān)。

(a) BC-ZnOT0，(b) BC-ZnOT0.1，(c)BC-ZnOT1圖1 BC-ZnO的X光衍射圖

2.1.2ZnO的含量

添加不同濃度Triton X-100制備所得BC-ZnO中ZnO的含量見表1。大量的ZnO被載入BC中，BC-ZnO中的ZnO的含量都大于50%。發(fā)現(xiàn)隨著Triton X-100添加量的增加，負(fù)載的ZnO的量越多。

表1 添加不同濃度Triton X-100制備所得BC-ZnO中ZnO的含量

2.2 形貌分析

2.2.1SEM

通過掃描電子顯微鏡觀察BC-ZnO的微觀結(jié)構(gòu)(圖2)。發(fā)現(xiàn)BC在堿性環(huán)境下經(jīng)過微波高溫反應(yīng)，依然能保持其三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且纖維絲寬度都小于100 nm。同時(shí)發(fā)現(xiàn)大量的納米ZnO都附著在纖維素周圍，表明納米ZnO載入BC中。由圖2觀察所得，隨著Triton X-100添加量的增加，載入BC中的ZnO顆粒團(tuán)聚越嚴(yán)重。

2.2.2TEM

從TEM圖(見圖3)中所得納米ZnO顆粒較均勻分布在纖維素上，但是納米ZnO的形狀不太規(guī)則，大部分呈橢圓形。利用Image J測量納米ZnO大小，每個(gè)顆粒較長的直徑為統(tǒng)計(jì)對象(表2)。BC-ZnOT0中的ZnO平均直徑約為59.50 nm，主要分布在40 nm～70 nm區(qū)間。BC-ZnOT0.1中的ZnO平均直徑約為59.11 nm，主要分布在40 nm～70 nm區(qū)間。BC-ZnOT1的ZnO平均直徑約為59.11 nm，主要分布在30 nm～50 nm區(qū)間。發(fā)現(xiàn)隨著Triton X-100添加量的增加，載入BC中的ZnO粒徑越小。

(a) BC-ZnOT0，(b) BC-ZnOT0.1，(c) BC-ZnOT1
圖2 BC-ZnO的掃描電鏡圖

(a) BC-ZnOT0，(b) BC-ZnOT0.1，(c) BC-ZnOT1，(d) BC-ZnO的粒徑分布圖
圖3 BC-ZnO的透射電鏡圖和粒徑分布圖

表2 添加不同濃度Triton X-100制備所得BC-ZnO中ZnO的平均粒徑

2.3 材料抗菌性分析

從圖4看出，BC-ZnO對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白假絲酵母都有較好的抗菌性能。即說明BC-ZnO對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都有抗菌性。從表3得出，BC-ZnO對革蘭氏陽性菌的抗菌效果明顯優(yōu)于革蘭氏陰性菌和真菌。并且BC-ZnOT1的抗菌性能好于BC-ZnOT0和BC-ZnOT0.1。說明隨著Triton X-100添加量的增加，BC-ZnO抗菌性能越強(qiáng)。

金黃色葡萄球菌

大腸桿菌

白假絲酵母

(a) BC-ZnOT0，(b) BC-ZnOT0.1，(c) BC-ZnOT1
圖4 BC-ZnO的抑菌圈

表3 添加不同濃度Triton X-100制備所得BC-ZnO的抑菌圈大小(mm)

3 討論與結(jié)論

添加表面活性劑Triton X-100，使合成得到BC-ZnO中的ZnO的含量提高，并且ZnO的粒徑更小。這可能是BC-ZnOT1的抗菌性能好于BC-ZnOT0和BC-ZnOT0.1的原因。也有報(bào)道，合成納米ZnO過程添加表面活性劑使納米ZnO的形態(tài)發(fā)生變化，越小的納米ZnO的抗菌性能也越好[9]。

本研究利用微波合成方法成功制備了納米ZnO載BC的納米復(fù)合材料。該材料能對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都有抗菌能力。并且對革蘭氏陽性菌的抗菌性能優(yōu)于革蘭氏陰性菌和真菌。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在合成過程中添加表面活性劑Triton X-100能明顯影響載入BC中的納米ZnO。隨著Triton X-100添加量的增加，制備所得ZnO的粒徑越小，BC負(fù)載的ZnO的量越多，BC-ZnO抗菌性能越強(qiáng)。本研究為進(jìn)一步開發(fā)抗菌BC作為外科敷料和食品包裝材料奠定基礎(chǔ)。